第四组SDS-PAGE测定酶

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,SDS-PAGE测定酶,1,目录,一、实训目的,二、实训原理,三、实训材料,四、实训步骤,2,一、实训目的,掌握,SDS-PAGE,电泳技术的原理、凝胶配制等知识,能够熟练进行加样,能够正确使用电泳仪,3,二、实训原理,1.SDS-PAGE分离样品的主要依据是各种物质分子量的差异性。当SDS与各种酶分子结合后，酶分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷。因此在电泳时，电泳迁移仅取决于分子量大小而与其所带的电荷无关。,4,三、实训材料,1.试剂,30丙烯酰胺溶液(Acrylamide-Bis,),配置100mL:29克丙烯酰胺，1克甲叉双丙烯酰胺，置于250mL烧杯中，向烧杯中加入约80mL的去离子水，充分搅拌溶解，最后定溶100mL，置于棕色瓶4保存。,0.5moL/L浓缩胶缓冲液,配置100mL ：6.0克Tris，置于100mL烧杯中，加80mL去离子水搅拌溶解；用HCl调节pH值到6.8，加水混匀定容至100mL。,1.5moL/L分离胶缓冲液,配置100mL :18.2克Tris、置于100mL烧杯中，加80mL去离子水搅拌溶解；用HCl调节pH值到8.8，加水混匀定容至100mL。,5xTris-甘氨酸电极缓冲液,组分浓度0.125moL/L Tris，1.25moL/L Glycine,0.5%(m/v)SDS；,配置1L：15.1克Tris，94克甘氨酸、5克SDS，加水混匀定容至1L，室温保存,10（m/v）过硫酸铵,配置10mL：1克过硫酸铵溶于l0ml蒸馏水中，临用前配制。,5,10（m/v）SDS,配置10mL:配置方法同过硫酸铵,2x样品处理液,组分100mmol/L Tris-HCl（Ph6.8），4%（m/v）SDS, 0.2,（m/v）溴酚兰,20%（体积倍数）甘油，2%（m/v）-巯基乙醇；,配置量5mL：取1mol/L Tris-HCl （Ph6.8）0.5mL，SDS 0.2g，溴酚蓝10mg，甘油1mL，加水溶解定溶至5mL。小份分装，0.5mL一管，室温保存。使用前将25L的-巯基乙醇加入混匀,考马斯亮蓝染色液,配置量1000mL：称取0.125%考马斯亮兰R-250 1.25g，250mL甲醇或乙醇，80mL乙酸，加蒸馏水补足1000mL。充分混匀后进行过滤，收集滤液备用。,脱色液,7醋酸,蛋白质样品,46kda的酶,其他试剂,15g/L琼脂糖溶液（封胶用）（用1x Tris-甘氨酸电极缓冲液配置）,6,2.仪器,1.电泳仪,2.电泳槽及灌胶模具,3.电炉,4.微量移液器,5.烧杯、量筒、摇床等,7,四、实训步骤,1.准备工作,将垂直板型电泳装置的玻璃片洗干净，晾干，嵌入凹槽中，夹好。将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上。,8,2.,分离胶的制备,按比例取试剂立即混匀，将混合液，迅速在电泳槽的两玻璃板之间灌注，留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加0.51cm）。用滴管小心地在溶液上覆盖一层蒸馏水，以隔绝空气中的氧气，并使胶面平整。将电泳槽垂直静置于室温约1h或更长，待分离胶聚合完全后（水封层和凝胶面之间会出现明显的水胶分界线），倾出覆盖的水，再用滤纸吸净残留水（注意勿将滤纸碰到胶面）。准备灌注浓缩胶。,9,3.,浓缩胶的制备,在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，梳底距离分离胶至少有0.51cm。,10,4.样品的处理,在待测酶样品中按1:1体积比加入2倍样品处理液，在100沸水中加热35min以使酶变性。另外选择相对分子量大小合适的标准蛋白质作为参照，并做同样处理。,11,5.加样,待浓缩胶完全聚合后，小心移出梳齿，用电极缓冲液洗涤加样孔数次，然后将凝胶固定于电泳装置上，槽中加入Tris-甘氨酸电极缓冲溶液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。用微量注射器向凝胶梳孔内加样，动作轻缓、准确、迅速，防止窜孔。,12,6.电泳,接上电泳仪，上电极接电源的负极，下电极接电源的正极。电泳时，调节电流至2030mA并保持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距离凝胶下端约1cm时，关闭电源停止电泳。,7.剥胶,电泳结束后小心从电泳装置上卸下玻璃板，将胶取出，注意凝胶的完整性。,13,8.染色和脱色,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的酶样品可用考马斯亮蓝R250染色。将凝胶完全浸入固定染色液中放摇床上，轻轻摇动使染色均匀，染色12h或过夜，至显出条带。染液收回，用水洗去凝胶表面染液，加脱色液脱色，需310小时，期间更换多次洗色液至背景无色。,9.凝胶保存,可用7%醋酸或20%甘油保存，也可拍照、扫描或脱水制成干胶保存。,14,10、相对分子质量的计算,10、相对分子质量的计算,（1）电泳相对迁移率的计算,用直尺分别量出标准蛋白质、待测酶区带中心以及溴酚蓝距分离胶顶端的距离，按以下公式计算相对迁移率：,15,（2）标准曲线绘制,以各标准蛋白样品的相对迁移率为横坐标，其相对分子质量（M,r,）的对数值为纵坐标，在坐标纸上作图，可拟合绘制一条标准曲线。,（3）待测酶样品相对分子质量的计算,根据待测酶样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量的对数值，再进一步算出酶样品的相对分子质量。,16,分离胶,分离胶（单位kD）,150以上：6%；,100150：8%；,50100：10%；,2050：12%；,20以下：16%。,一般为这个范围，也可有些许的差异。,17,分离胶制备 （12% 10ml),H,2,O 3.35ml,1.5M Tris(PH8.8) 2.5ml,10% SDS 0.1ml,Acr/Bis 4.0ml,10% 过硫酸铵 0.05ml,TEMED 0.005ml,18,浓缩胶制备 （5% 5ml),H,2,O 3.6 ml,单体溶液（30%） 0.62ml,1M Tris(PH6.8) 0.63ml,10% SDS 0.05ml,10% 过硫酸铵 0.05ml,TEMED 0.005ml,压缩胶一般都为5%；,19,谢谢观看,20,