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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,LC-MS/MS样品分析一般步骤,SEP 16 2002,1,准备工作,1.核对样品,名称,编号.2.,通过询问送样人,查阅文献等,了解样品其他知识,例如熔点,沸点,溶解性等理化性质,样品来源,光谱,波谱数据等, LC,条件,可能的杂质,样品含量,色谱柱类型,规格,流动相,流速等等,.,原来溶剂,若不合适,N2,吹干,再用甲醇或乙睛定量溶解,.,保存状况,对温度,光敏感否,送样前一定要摸好,LC,条件，能够基本分离，缓冲体系符合,MS,要,求.3.,浓度非常低的样品不能保存太长时间,容器吸附,、,分解等原因使样品浓度降低,标准品工作液现配现做,.,2,先定性后定量,首先,察看存在哪些离子,通过改变DP,观察离子的增减,M+1,18,23等等,初步判断分子量,再进行PRODUCT SCAN,找出碎片信息,从中选定MRM需要测定的一对或更多离子对,为最后LC-MS/MS联用做准备.,3,特征离子的,质量色谱,在复杂混合物分析及痕量分析时是,LC,MS,测定中最有用的谱图，当样品浓度很低时,LC,的,TIC,上往往看不到峰,此时,根据上一步得到的分子量信息,输入,M+1,或,M+23,等数值,观察提取离子的质量色谱图,检验直接进样得到的信息是否在,LC-MS,上都能反映出来,确定,LC,条件是否合适,然后进行,MRM,测定,.,4,正离子方式常出现如下离子:,-Na 22 Da. higher than M+H,-K 38 Da. higher than M+H,-Li 9 Da. higher than M+H,-NH4 17 Da. higher than M+H,-ACN 40 Da. higher than M+H,2M+H,2M+Na,等,5,负离子方式常出现如下离子:,-TFA 114 Da. higher then M-H (113 and 227 background),-Acetate 60 Da. higher then M-H,-Formic 46 Da. higher then M-H,-Cl 36 Da. higher than M-H,6,根据样品性质确定,离子化方式,:,高极性化合物,大分子,蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子；胺类、季铵盐等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯等,适合,ESI(IS),。弱极性,/,中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等，适合,APCI,（,HN,）。,ESI,不行的：极端非极性化合物如苯等,;APCI,不行的：非挥发性样品,;,热稳定性差的样品。碱性化合物宜用正离子方式，酸性化合物宜用负离子方式，如未知,可能,正负,都要做,有些化合物,正负,都出峰,选择灵敏度高的方式,不明确的优先用,正,离子方式试,。,7,影响分子量测定的因素,1）PH的影响-正离子方式PH要低些,负离子方式PH要高些,除对离子化有影响外,还影响LC的峰形,以至定量误差。,2）气流和温度,当水含量高及流量大时要相应增加.,3,）溶剂和缓冲液流量,流速适当高可以提高出峰灵敏度,.,8,4）溶剂和缓冲液的类型,正离子甲醇好,负离子乙腈好些,不挥发性盐的影响-大量累积使仪器灵敏度下降. 5）根据样品结构和性质,选择合适的液相色谱类型. 6）合适的电压-样品在源内分解或碎裂,温度,DP电压要适当. 7) 杂质的影响,溶剂的纯度,水-纯净水,当成分复杂，杂质太多时,竞争使被测物离子化不好,同时使LC分离不好.,8,）样品浓度不够,-,浓缩,.,9,样品的预处理常用方法有,:,a,）超滤,b,）溶剂萃取去盐,c,）固相萃取,d,）灌注（,Perfusion,）净化去盐,e,）色谱分离,反相色谱分离,亲和技术分离,10,母离子选,M+H,或,M-H,最好,但有时只有,M+NH4,M+Na,等,这样,CAD,能量可能需要高些,子离子当然选相对丰度高的,可以不只一个,通过优化仪器参数,使得母子离子都达到一定强度平衡,使,MRM,灵敏度最高,.,11,色谱柱的选择原则,:,定性可长些,定量尽量短,提高效率,细径柱如,2mm,的,1mm,的,IS,可不分流,如,4.6mm,柱用,1ml,流量时灵敏度还不是最佳,不如流量低时更好,.,12,优化仪器,先用注射泵优化,COMPOUND,项下面的参数,如,DP,CE,及,CAD,等,再接通,LC,用,FIA,优化其他参数及源位置,或接一个三通,样品仍由注射泵进入离子源,同时,LC,保持需要的流量,.,13,内标物与被测物的化学性质有区别时,要注意干扰基质对他们的离子化影响的不同,，尽量选同系物。,14,色谱柱和管路的清洗,新的色谱柱可能要先冲洗很长时间才能干净,某些样品非常容易吸附在进样阀和管路中,进样顺序要先稀后浓,.,15,调机时,注意标尺不要偏差太大,先用标准品校准仪器,如偏差很小,可不用重新校准仪器,做,PRODUCT SCAN,时,注意小数点后的位数,MRM,输入要准,灵敏度才高,.,16,LC梯度的设定,目的是快速分离,峰形好,缩短时间,提高效率,选短柱亦是如此.,17,溶解被测物最好用流动相,或纯甲醇,乙睛,如果溶剂含水比流动相多,则,峰形不好,变宽,定量不准,.,18,优化质谱仪器,调整,LC,参数,选择进样方法等所有的工作都是为了使仪器灵敏度最高,选择性最好,使得被分析物能够被准确无误的测定,.,19,
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