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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,第,7,章,PCR,技术及其发展和应用,郑州大学生命科学学院,马珊珊,mss,目,录,PCR,技术简介,PCR,技术的衍生技术,实时荧光,PCR,技术,PCR,技术的应用,3,一、,PCR,技术简介,聚合酶链式反应（,polymerase chain reaction, PCR,）,是一种模拟天然,DNA,复制过程的核酸体外扩增技术。它是在体外条件下，利用,DNA,聚合酶通过多次循环的合成反应催化一端特异,DNA,片段的合成。,1.PCR,的基本原理和步骤,The Nobel Prize in Chemistry 1993,for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method,Mullis F,4,一、,PCR,技术简介,1.PCR,的基本原理和步骤,（,1,）变性（,denaturation,）：,模板,DNA,经热变性，双链被解开，成为两条单链。,（,2,）退火（,annealing,）：,温度下降，变性,DNA,复性，使寡核苷酸引物即与模板,DNA,中所要扩增序列两端的碱基配对。,（,3,）延伸（,extension,）：,在适宜条件下（包括,DNA,聚合酶和核苷酸单体），引物,3,端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的,DNA,链。,PCR,类似于体内,DNA,复制过程。变性、退火和延伸。,PCR Cycle Step1,变性（,95,）,Target Sequence,Target Sequence,模板,DNA,的变性：模板,DNA,经加热至,93,左右一定时间后，使模板,DNA,双链或经,PCR,扩增形成的双链,DNA,解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板,DNA,与引物的退火,(,复性,),：模板,DNA,经加热变性成单链后，温度降至,55,左右，引物与模板,DNA,单链的互补序列配对结合；,PCR Cycle Step2,退火（低温,）,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq,DNA,Polymerase,引物的延伸：模板,-,引物结合物在,DNA,聚合酶的作用下，以,dNTP,为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板,DNA,互补的链。,PCR Cycle Step3,延伸（,72,）,End of the 1st PCR Cycle ,Results in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,Target Amplification,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target,12,1,=2,22,2,=4,32,3,=8,42,4,=16,52,5,=32,6 2,6,=64,20 2,20,302,30,1,cycle = 2 Amplicon,2,cycle = 4 Amplicon,3,cycle = 8 Amplicon,4,cycle = 16 Amplicon,5,cycle = 32 Amplicon,6,cycle = 64 Amplicon,7,cycle = 128 Amplicon,10,一、,PCR,技术简介,2.PCR,反应,标准的,PCR,反应条件：,10X,缓冲液,10,L,4,种,dNTP,混合物 各,200umol/L,Taq,DNA,聚合酶,2.5U,Mg,2+,1.5mmol/L,引物 各,10,100pmol,模板,DNA,0.1,2,g,水 补足体积,2Mix,11,一、,PCR,技术简介,2.PCR,反应,12,一、,PCR,技术简介,2.PCR,反应,13,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,1,3,步,25,30,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,子链延伸,DNA,加倍,DNA,变性,形成,2,条单链,模板,DNA,95,一、,PCR,技术简介,2.PCR,反应,14,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,95,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,15,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,16,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,1,轮结束,95,第,2,轮开始,17,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,18,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,2,轮结束,19,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,重复,30,轮后,2,30,=1,073,741,824,模板,DNA,第,1,轮扩增,第,2,轮扩增,第,3,轮扩增,第,4,轮扩增,第,5,轮扩增,第,6,轮扩增,理想拷贝数,=2,n,n,循环次数,实际拷贝数,=(1+x),n,X,平均效率,约为,0.85,n,循环次数,20,PCR,产物的积累规律示意图,21,灵敏度高,皮克,(pg=10,-12,),量级扩增到微克,(ug=10,-6,),水平,简便、快速,一次性加好反应液，,2,4,小时完成扩增,对标本的纯度要求低,血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提,DNA,一、,PCR,技术简介,2.1 PCR,反应的特点,CK(ul),1#(ul),模板,0,1,引物,1,0.5,0.5,引物,2,0.5,0.5,10,PC,R Buffer,2,2,Taq,酶,0.2,0.2,dNTPs,0.5,0.5,ddH O,2,16.3,15.3,Total,20,20,（,1,）在,0.,2 ml PCR,管内配置,20ul,反应体系：,一、,PCR,技术简介,2.2 PCR,反应的实验步骤,（,2,）,PC,R,反应程序,(1) 94,变性,5min,，,(2) 94,变性,1min,，,(3) 52 ,退火,1min,，,(4) 72 ,延伸,1min,。,(5) 72 ,延伸,10min,。,(6) 4 ,保存。,重复,(2)-(4)30,次,一、,PCR,技术简介,2.2 PCR,反应的实验步骤,PCR,结果：,1,、对照,(,无模板,),；,2,6,、,PCR,产物（,5ul,样品）,（,3,）,PCR,产物的电泳鉴定,一、,PCR,技术简介,2.2 PCR,反应的实验步骤,Lambda DNA,，模板量分别为,100 pg, 10pg, 1pg, 100fg , 10fg,25,一、,PCR,技术简介,3. PCR,的影响因素,3.1 DNA,模板,单、双链,DNA,均可，多种来源。,质量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、,DNA,聚合酶抑制剂、,DNA,结合蛋白类。,一般人基因组,100,ng,DNA,模板（,100,L,）。,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,26,一、,PCR,技术简介,3.2,引物,27,一、,PCR,技术简介,3.2,引物,引物设计的原则：,引物长度在,15,30,碱基。,引物中碱基的分布是随机的，,G+C,含量宜在,45,55,左右。,引物内部避免形成发夹结构；引物间避免形成二聚体。,引物,3,端为关键碱基；,5,端无严格限制,引物的特异性，避免在模板内存在较高的相似性序列。,28,一、,PCR,技术简介,3.2,引物,引物设计的常用软件：,Primer Premier 5.0,Oligo 6,primer 5,The Primer Generator,Net Primer,1.,将序列输入软件中,（,2,）,在表中,粘贴序列,（,1,）,新序列,两个方法,选择序列文,件所在位置,（,2,）,打开,原有的序,列文件,在对话框中输入待扩增序列,点击左上角的,“,Primer”,按钮,2.,设置相关参数,3.,得到的引物结果,Hairpin:,引物自身是否会形成发夹结构,Dimer:,同一种引物是否会形成二聚体,False primiring:,引物在待扩增序列中其他位置是否,有配对,Cross Dimer:,正向与反向引物间是否会形成二聚体,正向和反向,引物的评价,正向和反向,引物的信息,每点击左,边红色的,按钮，就,出现相应,的内容,对正向和反向引物进行编辑,正向和,反向引,物的互,换,可对引物进行,增加或减少碱基,用键盘输入,5,个碱基,引物的信息,改动后引物的信息,重新回到双引物的界面,“Edit”,“,Copy”,“,Sense Primer,”,5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 3,4.,输出引物序列,39,一、,PCR,技术简介,3.3,耐热,DNA,聚合酶,1,）,T,aq DNA,聚合酶（,Taq polym,erase,） ：,95,的半衰期为,40min,，,最适温度（,72,）时每个,酶分子每秒可催化合成,150,个核苷酸。,酶活性（受多种因素影响）：,5,3,方向的聚合酶活性,，,5,3,方向的外切酶活性和逆转录酶活性，,非模板依赖性活性,，使,PCR,产物的,3,端突出一个,单,A,核苷酸尾,40,Tth DNA,聚合酶：,用于一步法,RT-PCR,。,Vent DNA,聚合酶：,其保真性较,Taq DNA,聚合酶高一倍。该酶扩增长片断（,12kb,）的功能较强。,Pfu DNA,聚合酶：,其保真性比,Taq,聚合酶高,12,倍，是已知的保真性最高的聚合酶。但不适于,2kb,的片断扩增。,2,）其他的耐热聚合酶,一、,PCR,技术简介,3.3,耐热,DNA,聚合酶,41,一、,PCR,技术简介,3.4,dNTP,dNTP,浓度取决于扩增片段的长度，四种,dNTP,浓度应相等,浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度,过低则降低反应产量，终浓度一般在,100-200uM,。,dNTP,可与,Mg2+,结合，使游离的,Mg2+,浓度下降，影响,DNA,聚合酶的活性。,42,一、,PCR,技术简介,3.5 Mg2+,浓度,Mg2+,是,DNA,聚合酶的激活剂。,0.5mmol/L-2.5mmol/L,反应体系。,Mg2+,浓度过低会使,Taq,酶活性丧失、,PCR,产量下降；,Mg2+,过高影响反应特异性。,Mg2+,可与负离子结合，所以反应体系中,dNTP,、,EDTA,等的浓度影响反应中游离的,Mg2+,浓度。,43,一、,PCR,技术简介,3.6,反应参数,（,1,）变性：,90-95 ,，,30-60s,（,2,）退火：,温度由引物长度和,GC,含量决定。一般,30s,即可。,（,3,）延伸：,一般,72 ,，延伸时间由扩增片段长度决定，一般,1kb/min.,（,4,）循环次数：,主要取决于模板,DNA,的浓度，一般为,25-35,次。,44,一、,PCR,技术简介,4. PCR,产物的检测,琼脂糖凝胶电泳：,最常用的方法。分辨率高，可测出,1ng DNA,。,聚丙烯酰胺凝胶电泳：,灵敏度比琼脂糖凝胶电泳高，主要用于分离小于,1kb,的片段，因此特别适用于合成的片段的分离和检测。,层析技术：,广泛应用于,DNA,的合成及其扩增后的分离纯化。,分子杂交：,包括点杂交和,Southern,印迹杂交。,45,二、,PCR,技术的衍生技术,逆转录,PCR,（,revers,e transcription PCR,，,RT-PCR,）,反向,PCR,（,inverse PCR,）,巢氏,PCR,（,nesting,PCR,）,原位,PCR,（,in situ,PCR,）,突变,PCR,（,mutation,PCR,）,多重等位基因,PCR,（,multiplex,allele PCR,）,不对称,PCR,（,asymmert,ric,PCR,）,实时定量,PCR,（,real time,PCR,）,二、,PCR,技术的衍生技术,47,二、,PCR,技术的衍生技术,1.,逆转录,PCR(reverse,transcription-PCR, RT-PCR),RT-PCR,是扩增,RNA,的,PCR,反应，包括两个步骤：,在单引物的介导下以,RNA,为模板利用逆转录酶催化合成,RNA,的互补链,cDNA,，即逆转录。,以,cDNA,为模板，在特异性引物引导下，扩增合成靶,DNA,分子，即普通,PCR,。,48,二、,PCR,技术的衍生技术,1.,逆转录,PCR(reverse,transcription-PCR, RT-PCR),49,二、,PCR,技术的衍生技术,1.,逆转录,PCR,的应用,测定基因表达的强度,鉴定已转录序列是否发生突变,呈现,mRNA,多态性,克隆,mRNA,的,5,和,3,末端序列，,从非常少量的,mRNA,样品构建大容量的,cDNA,文库。,50,二、,PCR,技术的衍生技术,1.,逆转录,PCR,的影响因素,（,1,）,模板对,RT-,PCR,的影响,对,RNA,制,品的纯度和完整性要求都极为严格。,RNA,分子,必需完整，其次,RNA,样品中不能含有,DNA,、蛋白质等杂质。,（,2,）逆转录酶对,RT,-PCR,的影响,MLV,逆转录酶能合成大于,2kb,的较长,cDNA,，但对热的稳定 性较,AMV,逆转录酶差。,51,（,3,）逆转录引物对,RT-PCR,的影响,随机引物：,原核细胞多用，,6-10bp,，含有四种碱基的任意组,合，可在,RNA,多个位点与之结合，引导合成长短不一的,cDNA,。,oligo(dT,),：,真核细胞多用，,12-18bp,的,oligo(dT,),与真核生物,的,mRNA,的,polyA,尾巴特异结合，引导全长,mRNA,的合成。,基因特异性的引物,(,GSP,),：,特异性强，广谱性低，,GSP,一次只针对一个基因，不适合多基因检测或表达差异比较的研究。,二、,PCR,技术的衍生技术,1.,逆转录,PCR,的影响因素,52,二、,PCR,技术的衍生技术,1.,逆转录,PCR-,举例,RNA,提取,RT-PCR,电泳分析,53,二、,PCR,技术的衍生技术,2.,反向,PCR,（,inverse PCR,）,用反向的互补引物来扩增两引物以外的,DNA,片段，对,某个已知,DNA,片段两侧的未知序列进行扩增。,已知序列,未知序列,未知序列,54,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,二、,PCR,技术的衍生技术,2.,反向,PCR,（,inverse PCR,）,55,探索邻接已知,DNA,片段的序列；,用于仅知部分序列的全长,cDNA,的克隆,-RACE,；,建立基因组步移文库,-Gene Walking,。,56,二、,PCR,技术的衍生技术,2.,反向,PCR,（,inverse PCR,）,应用：,（,1,）用于测序的,DNA,大片段的克隆,（,2,）获得启动子序列,（,3,）小质粒的定点突变,（,4,）鉴定插入失活基因或体内诱导基因,57,二、,PCR,技术的衍生技术,3.,巢式,PCR,（,Nest,PCR,）,巢式,PCR,是一种变异的聚合酶链反应,(PCR),，使用两对（而非一对）,PCR,引物扩增完整的片段。,第一对,PCR,引物扩增片段和普通,PCR,相似。,第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次,PCR,扩增片段的内部）结合在第一次,PCR,产物内部，使得第二次,PCR,扩增片段短于第一次扩增。,58,59,巢式,PCR,的优点：,特异性高。如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。,由于第二套引物位于第一轮,PCR,产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种巢式,PCR,扩增确保第二轮,PCR,产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。,60,二、,PCR,技术的衍生技术,4.,突变,PCR,突变是改变,DNA,序列的最基本的方法，用以鉴定一个基因或,DNA,片段的功能，研究蛋白质结构,-,功能关系。主要分为：,随机突变：,在目的基因的任意位点引入点突变，建立,突变文库。,定点突变：,在选定的位点对,DNA,序列进行修改，主要通,过引物点突变、碱基或小片段的插入或删除。,61,（,1,）,随机突变：,应用：,构建突变体文库，继而可从中筛选出具有特殊,性质的突变个体,策略：,易错,PCR,（,error-pr,one PCR,）。,利用,Taq,DNA,聚合酶等耐热,DNA,聚合酶不具有,3,5,校对功能的特性，在,PCR,扩增反应中可能掺入错误的核,苷酸，从而产生,随机错误的扩增产物。,二、,PCR,技术的衍生技术,4.,突变,PCR,62,（,2,）定点突变,A. 5,端引入突变,：通过修饰上游引物的,5,端，即可引入标记的碱基、限制性酶切位点、启动子序列等。,B.,序列中的单位点突变,：采用重叠延伸,PCR(Overlap,Extension PCR,，,OE PCR),二、,PCR,技术的衍生技术,4.,突变,PCR,63,（,A,）为,5,端引入突变,（,B,）为单碱基突变,二、,PCR,技术的衍生技术,（,B,）,Site-directed Mutagenesis (Kit),65,大多数大肠杆菌菌株中含有,Dam,甲基化酶和,Dcm,甲基化酶，来自大肠杆菌的质粒,99,发生甲基化；,PCR,产物是去甲基化的产物；,DpnI,识别甲基化位点并切割,DNA,，而去甲基化扩增产物不会被降解；,经过转化，,PCR,产物链经过修复形成环状，从而完成突变,66,（,3,）多位点突变,策略：,多次重叠,PCR,关键：,重叠引物的设计（每对突变引物需要部分重叠，方,向相反）。,二、,PCR,技术的衍生技术,67,二、,PCR,技术的衍生技术,5.,原位,PCR,（,in situ,PCR,）,原位,PCR,是由,Hasse,等于,1990,年首创。,它是利,用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增,细胞内的目的片段。,在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。,直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行,PCR,扩增，可进行细胞内定位。,适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。,68,操作步骤：,1.,细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理,后便适于一般,PCR,试剂（包括引物和,Taq,酶）进入,2.,原位,PCR,扩增细胞内目的片段,3.,原位杂交检测扩增产物,A.,阳性对照,B.,阴性对照,C.,原位检测,mR,NA,表达,二、,PCR,技术的衍生技术,69,实现了,PCR,从定性到定量的飞跃，能够对,PCR,反应的全过程进行实时监控，并且自动化程度高，成为分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。,三、实时荧光,PCR,技术,荧光定量,PCR,技术是在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号随着,PCR,反应的积累来实时监控,PCR,反应的进程，并通过软件对,PCR,反应中起始模板进行定量及定性的分析。,系统组成：,定量,PCR,仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。,三、实时荧光,PCR,技术,1.,实时定量,PCR,技术原理,71,PCR,扩增时，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对,PCR,产物进行标记跟踪，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条,DNA,链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与,PCR,产物形成完全同步。,三、实时荧光,PCR,技术,1.,实时定量,PCR,技术原理,72,三、实时荧光,PCR,技术,2.,常用荧光标记试剂和方法,非特异性荧光染料标记,SYBR Green I,特异性荧光探针标记,TaqMan,Probe,73,三、实时荧光,PCR,技术,2.1,荧光染料,SYBR Green I,是目前定量,PCR,最常用的一种荧光染料。,SYBR Green I,是一种结合于所有双链,DNA,双螺旋小沟中具有绿色激发波长的染料。与双链,DNA,结合后，其荧光大大增强，荧光强度与双链,DNA,分子的数量有关，因此可根据荧光信号检测出,PCR,反应体系中双链,DNA,分子的数量。,SYBR Green I,74,热 变 性,引物退火,延伸反应,三、实时荧光,PCR,技术,2.1,荧光染料,-,作用机理,75,使用方便，不必设计复杂,探针,具有价格优势,优 点,无模板特异性,对引物特异性要求较高,不能进行多重定量,灵敏度相对较低,缺 点,三、实时荧光,PCR,技术,2.1,荧光染料,-,优缺点,76,三、实时荧光,PCR,技术,2.2,荧光探针,（,1,）,Taqman,探针,原理,5,端标记有报告基团,(Reporter, R),，如,FAM,、,VIC,等,3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher, Q),探针完整，,R,发射的荧光能量被,Q,基团吸收，无荧光,;R,与,Q,分开，发荧光,Taq,酶有,53,外切核酸酶活性，可水解探针,77,热变性,引物和探针与模板退火,延伸反应,探针,报告基团,淬灭基团,探针,DNA,聚合酶,引物,R,R,R,R,三、实时荧光,PCR,技术,（,1,）,Taqman,探针,工作机理,78,高度特异性,重复性好,灵敏度高,可进行多重定量,优 点,只适合一个特定的目标,委托公司标记，价格较高,不易找到本底低的探针,缺 点,三、实时荧光,PCR,技术,（,1,）,Taqman,探针,优缺点,79,三、实时荧光,PCR,技术,2.2,荧光探针,（,2,）其他探针,分子信标,双杂交探针,蝎型探针,自身淬灭荧光探针,80,三、实时荧光,PCR,技术,3.,实时定量,PCR,常用的三个概念,扩增曲线,荧光阈值,Ct,值,荧光基团,三、实时荧光,PCR,技术,A,、扩增曲线,扩增曲线的两种形式,.,左图反映的是随着,PCR,反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短；右图反映的是荧光信号的变化量的对数与,PCR,反应循环数的关系，从右图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。,Cycle,（循环数）,Rn,（荧光强度）,基底期,指数期,平台期,三、实时荧光,PCR,技术,A,、扩增曲线,83,在荧光定量,PCR,扩增的指数期，画一条线，在此直线上，,所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。,三、实时荧光,PCR,技术,B,、阈值线,84,PCR,扩增过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所对应的扩增循环数。,三、实时荧光,PCR,技术,C,、,Ct,值,85,横轴：,PCR,反映循环数,纵轴：荧光信号量,Ct,值的特点：,相同模板进行,96,次扩增，终点处产物量不恒定；,Ct,值极具重现性,三、实时荧光,PCR,技术,Ct,值的重现性,86,Ct,值与初始模板含量,Ct,值与初始,模板浓度的对数值,成线性关系,初始模板量越多，,C(t,),值越小,10,6,10,5,10,4,10,3,10,2,10,三、实时荧光,PCR,技术,87,定量原理,初始,DNA,量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少（,Ct,值）；,利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，只要获得位置样品的,Ct,值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数（模板量）。,确定初始模板的浓度,三、实时荧光,PCR,技术,三、实时荧光,PCR,技术,4.,绝对定量与相对定量的比较,89,绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。,将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。,绝对定量通过标准品定量,90,2.,绝对定量标准品的标准,必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同,标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是,ASP-3700,紫外光,/,可见光微量分光光度计）,标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数）,在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定,CT,值,标准样品的种类：,含有目的基因的线性化的质粒,DNA,含有和待测样品相同扩增片段的,cDNA,PCR,的产物,91,3.,标准品的制备,根据已知拷贝数的质粒,DNA,，做系列稀释。,一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。,绝对,定量：从荧光到拷贝数,93,4.,实例,标准品的制作：将标准品依次进行,10,倍稀释，,ASP-3700,测得其拷贝数,1.55,10,8,copy /,ul,。,标准曲线的绘制（,1cycle=1min,）设置对照：浓度为,1.55,10,7,、,1.55,10,6,、,1.55,10,5,、,1.55,10,4,、,1.55,10,3,、,1.55,10,2,、,1.55,10,1,的标准样品各一个，设空白对照,PCR,反应：以不同浓度标准品作为模板,94,标准品的扩增曲线,标准品的标准曲线图,95,相对定量通过内标定量,相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）；,内标（,Endogenous Control,）通常是,-actin,、,GAPDH,，,18SrRNA,等看家基因；,内表基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小；,内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量。,97,相对定量的计算方法：,C,T,值比较法,目的基因和,b-actin,，最好每个标本重复三组，取其,Ct,值的均值,。,目的基因的平均值,-,actin,的平均值，得出,Ct,。,Ct,中的最大值分别依次减各个平均值，得出,Ct,。,或者各个平均值减最大值，得出,-,Ct,（负值）。,4. 2,Ct,，若,Ct,为负值，则用,2,-,Ct,，求值,，,做,柱状,图。,2,-,Ct,三、实时荧光,PCR,技术,5.,荧光定量,PCR,与普通,PCR,的比较,99,灵敏度高,:,灵敏的荧光检测较电泳检测灵敏度高,特异性高,:,使用引物和荧光探针同时与模板特异性结,合，提高了,PCR,反应的特异性,定量准确,:,全程监控，准确的算法进行定量,无需跑胶，自动化程度高,三、实时荧光,PCR,技术,5.,荧光定量,PCR,与普通,PCR,的比较,100,三、实时荧光,PCR,技术,6.,荧光定量,PCR,的应用,定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（,SNPs,）分析等,绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，,GMO,定量检测等,相对定量研究：,mRNA,表达量分析，,siRNA,效果确认，,差异显示结果验证等,101,PCR,只是一个简单的不起眼玩艺,凯利,穆利斯（,Kary,Mullis),PCR,只是一个概念，所发生的奇迹是：,PCR,概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟,的技术，后者又上升成为新的概念。,它最大的特点就是能不断推出新形式。,摘自,M,aking PCR: A Story of,Biotechnology by Paul,Rabinow,四、,PCR,技术的应用,102,四、,PCR,技术的应用,基础研究,基因克隆，,DNA,测序，分析突变,疾病诊断,细菌、病毒、寄生虫检测，诊断,人类基因组工程,遗传图谱的构建，,DNA,测序，表达图谱,法医,犯罪现场标本分析,肿瘤,各种肿瘤检测,其他,103,思 考 题,1.PCR,技术的核心思想是什么？,2.,除了,PCR,技术，还有哪些核酸体外扩增的技术，了解其原理，比较其与,PCR,技术的优缺点。,3.,荧光定量,PCR,的定量原理是什么？,4.,举例说明,PCR,技术在各领域的应用。,
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