组织学基本技术

*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,组织学基本技术,内容提纲,组织的概念及研究内容,组织学技术简介,组织标本的制备,组织化学与免疫组织化学术,组织学的学习方法,1.,组织学（,Histology,）概念,研究机体的,微细结构,及其相关,功能,的科学。,2.,研究内容,是在细胞水平、亚细胞水平和分子水平上对机体进行研究。,一、组织学概念及研究内容,二、组织学技术简介,显微镜技术,组织化学术,图像分析术,细胞培养术和组织工程,显微镜技术,16,世纪末，荷兰的眼镜商詹森（,Zaccharias Janssen,）和他的儿子把几块镜片放进了一个圆筒中，结果发现通过圆筒看到附近的物体出奇的大，这就是现在的显微镜和望远镜的前身。,詹森制造的第一台复合式显微镜。其基本原理是使用两个凸透镜，一个凸透镜把另外一个所成的像进一步放大。,显微镜的发展史,世界上的第一架显微镜是荷兰眼睛匠詹森父子在,1590,年前后制成的 ，效果不理想。,前后经过伽利略和胡克改良，效果较好,。,1878,年，制成现代的光学显微镜 。,20,世纪,30,年代，制造了第一架电子显微镜 。,1981,年，扫描隧道显微镜应运而生。,根据光源不同，显微镜分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以,可见光,为光源，后者则以,电子束,为光源。,、光学显微镜,（一）普通光学显微镜 （二）荧光显微镜,（三）激光共聚焦扫描显微境 （四）暗视野显微镜,（五）相差显微镜 （六）偏光显微镜,（七）微分干涉差显微镜 （八）倒置显微镜,显微镜技术,尼康,E-600,光学显微镜,普通光学显微镜,由二部分构成：,光学部分,：包括聚光镜、物镜和目镜；,机械部分,：包括镜臂、载物台等。,尼康,E-600,光学显微镜,尼康,E800,荧光显微镜,荧光显微镜,由光源、滤片系统和显微镜三部分构成。光源为高压汞灯，用以产生波长短、能量高的紫外光。,原理：,紫外光激发标本中的荧光物质，使之产生各种不同颜色的荧光，通过观察荧光的分布与强弱来测定被检物质。,研究内容：,观察组织、细胞中有自发荧光或经荧光染料染色或标记的结构。,莱卡倒置显微镜,倒置显微镜：,组成和普通显微镜一样，不同处物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之上，后者在载物台之下。,研究内容：,观察细胞培养中活细胞的形态结构和生长变化情况。,倒置相差显微镜：,具有相差物镜，使活细胞的不同结构出现显著的明暗反差，并具有立体感。,二、电子显微镜,透射电镜,扫描电镜,透射电镜,观察细胞的内部结构,观察细胞表面的立体结构,扫描电镜,透射电镜标本制备步骤,取材（约,1mm,3,）,双重固定,（双醛固定液和四氧化锇）,树脂包埋,超薄切片,重金属染色,电镜观察,脱 水,扫描电镜标本制备步骤,取材（直径约,0.3cm,）,双重固定,（双醛固定液和四氧化锇）,脱 水,干 燥,喷 镀,电镜扫描观察,显微组织标本的制备有多种方法，例如：切片法,（石蜡切片和冰冻切片）、涂片法、铺片法、,磨片法等。组织学中,最常用的方法是石蜡切片法,。,三、显微组织标本的制备,三、显微组织标本的制备,组织制片的意义和目的,组织标本制作的方法,组织切片标本制作的基本程序,苏木精,-,伊红染色的程序,组织制片的意义和目的,组织制片技术是随着生命科学的发展而不断进步的。利用组织切片染色,(staining),的方法所制出的标本显示了各种组织细胞的,不同结构和形态,，它们之间的相互连接及它们之中的某些化学成分的种类和含量的变化，为细胞分子学的研究提供了最直观的依据。因此，组织制片是研究医学和生物学的一个,最基本和最重要,的手段。,组织标本制作的方法,组织切片法,非组织切片法,组织切片法：,利用,化学试剂,将组织经过一系列的固定,(fixation),、脱水、透明后，再利用石蜡或火棉胶和明胶等支持物渗透进组织内部，使组织保持一定的硬度，并包埋,(embedding),成块，然后依靠切片机,(microtome),将包埋好的组织块切成以微米计的薄片，再根据需要进行各种染色得到的供显微镜下观察的标本的方法。包括：,石蜡切片、火棉胶切片、明胶切片，冰冻切片。,组织,不经过切片手续,制成的观察标本的方法为,非组织切片法,。包括：涂片、压片、铺片、磨片、消化分离、活体标本、整装标本、血管注射标本。,涂片：,将所采的血液或骨髓样品涂抹于载玻片上经瑞氏或姬姆萨染色后的标本。,压片：,先将组织处理成小块物质，然后经化学药品软化和染色，再用盖玻片压封于载玻片上的标本。例如运动终板等。,非组织切片法,铺片：,将需要观察的薄片组织用手工的方法直接铺于载玻片上，然后经过固定、染色等程序制成的标本。例如蛙的肠系膜铺片，大白鼠的皮下组织铺片等。,磨片：,骨，牙齿等组织，不经脱钙和切片，直接在磨石上用手工磨成大约,50,微米左右的薄片，然后再进行染色封固在载玻片上的标本。,消化分离：,将组织分离成小块，然后利用相应的化学药品水溶液将其细胞间质消化溶去，再用机械分离的方法，如利用水的震荡冲击力等，使小块组织分离成单个而又完整的细胞，经染色后涂于载玻片上封固的标本。例如平滑肌分离标本，脊髓的运动神经细胞等。,活体标本：,将所采的观察标本加生理盐水后直接滴于载玻片上在显微镜下观察。,整装标本：,一种是将胚胎或小动物经前期固定后整体封藏于盛满固定剂的透明容器中。另一种是将发育至某一阶段的鸡胚整体取出，经固定、染色、脱水、透明后封固于载玻片上的标本。,血管注射标本：,一种是将有色物质注射进血管，用酸或硷将血管周围的组织腐蚀后做成的整体封藏的血管标本。另一种是将有色物质注射进血管后，经一系列制片技术处理后封固于载玻片上供显微镜下观察的标本。,切片：用于具有一定硬度的组织，例如肝、肾等,涂片,:,用于液态组织，如血液，精液和唾液。,铺片,:,用于很薄的组织，如肠系膜。,磨片,:,用于很坚硬的组织，如骨和牙。,石蜡切片制作步骤,取材,固定,包埋,切片,染色,封片,石蜡切片的制备,（一）取材,注意事项：,材料,愈新鲜愈好,，动作要迅速、准确，防止组织发生变形、自溶；,取材所用的刀和剪要,锐利,，避免损伤组织；,取材部位要恰当、,准确,，易于说明问题；,所取组织块大小要,恰当,，便于固定液的渗透。组织的大小以,1X1X0.3cm,为宜，厚度一般不超过,0.5cm,。,（二）固定,目的：,使组织内的蛋白质迅速凝固或沉淀，防止细胞自溶或组织腐败，尽量保持组织的原有结构和化学组成。,单纯固定液,4%,中性甲醛：用,PH7.2-7.4,的,PBS,配制，配制后密封、,4,保存，保存时间不超过一个月。适用,HE,染色和免疫组化。,4%,多聚甲醛：用,PH7.2-7.4,的,PBS,配制。,乙醇混合固定液,复合固定液,AF,（乙醇,-,甲醛）固定液,Bouin,固定液,Carnoy,固定液,Zenker,固定液,固定液的种类,固定方法,浸透固定：将组织切成小块，直接,投入固定液中固定。,灌注固定：一般采用心脏灌注固定。,固定更加迅速、均匀。,尤其适用神经组织。,固定注意事项,及时固定：最好动物死后半小时内固定，一般不超过,2,小时。,固定液选择：根据组织的特点、染色方法选择合适的固定液。,固定液的量：一般为组织体积的,6-10,倍。,固定时间：在保存组织形态结构的同时，尽可能较好保存组织细胞的抗原。,固定温度：低温可以保持好的结构。,高效、方便、快捷的全自动形态检测平台！,（三）染色,HE,染色,（,hematoxylin-eosin staining,）,：组织学最常用的染色方法。,特殊染色：,硝酸银染色、醛复红染色、甲苯胺蓝染色等。,镀银染色,神经元,H.E,染色,苏木精,碱性染料,将嗜碱性物质染成蓝色,酸性染料,将嗜酸性物质,染成红色,细胞核中的染色质细胞质中的核糖体,多数细胞的细胞质,（线粒体,、,溶酶体,、,滑面内质网,）,HE,染色,嗜碱性,嗜酸性,伊红,细胞爬片制作,将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。,待细胞生长达到,60,以上后取出玻片。,用,4%,的多聚甲醛固定,2h,以上。,可加甘油封存置于零下,20,保存。,细胞涂片制作,离心将细胞收集出来，用预冷的,PBS,洗,2,3,遍，最后用,PBS,将细胞重悬。,吸取,30,50ul,（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。,待稍微风干以后加,4,多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定,2,4,小时。,在细胞上加一层甘油放,-20,保存。,组织化学技术概念：,应用,化学反应,或,免疫学反应,等原理检测组织和细胞的化学成分并进行,定位、定量,的技术。包括一般组织化学、免疫组织化学、原位杂交组织化学等。,四,、,组织化学与免疫组织化学术,原理：,组织细胞中的,物质,（核酸、糖类、脂类、蛋白质等）与,相应试剂反应,，最后形成有色终产物，通过有色终产物在细胞中的,定位,及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。,特点：,能在组织学标本上，定位、定性和定量地显示分布于组织或细胞内某些物质。,糖类,过碘酸,-Schiff,反应（,PAS,反应）,DNA ,福尔根反应（,Feulgen reaction,）,DNA,和,RNA,甲基绿,-,派若宁反应, 脂类,脂溶性染料（苏丹红、油红,O,等）, 酶类,生化反应,（一）一般组织化学术（,Histochemistry,）,PAS,反应：,确定组织或细胞中有无多糖存在的一种方法。反应产物呈紫红色。,Feulgen,反应：,显示,DNA,，呈红色。,甲基绿,-,派若宁反应：,同时显示,DNA,核,RNA,，,DNA,呈蓝绿色，,RNA,呈红色。,洋葱鳞茎内表皮细胞,苏丹红染色：,脂类物质呈红色。,冰冻切片对脂类物质保持较好。,酶类：,在适当温度和,PH,条件下，酶催化特异性底物形成初级反应产物，再用捕捉剂捕获该产物，形成镜下可见的有色沉淀物。该技术检测的不是酶本身，而是酶的活性。,（二）免疫组织化学术（,immunohistochemistry,）,1.,概念及原理：,根据,抗原和抗体,特异性结合原理，检测组织、细胞中多肽和蛋白质等大分子物质的一种技术。用标记的抗体与组织中的抗原结合，然后通过,化学反应,，将抗原抗体结合部位显示出来，借助显微镜观察，确定检测物质的,分布、含量,。,2.,标记物种类,荧光染料,：例如异硫氰酸荧光素（,FITC,），,四甲基异硫氰酸罗达明（,TMRITC,），,用荧光显微镜观察,酶类,：例如辣根过氧化物酶，用光镜或电镜观察。,胶体金,：多用于电镜观察。,免疫组织化学原理模式图,抗原 抗体 抗原抗体复合物,荧光素,辣根过氧化物酶,胶体金,3.,免疫组化技术的种类,根据,染色步骤,分：,直接法,：直接标记第一抗体。该法简单，特异性强，但敏感性较差。,间接法,：不标记第一抗体，标记第二抗体。该法敏感性较高。,特殊的间接法,：第一抗体和第二抗体均不标记，而是用酶标记与第二抗体结合的物质。该法敏感性高。包括,PAP,法、,ABC,法、,SABC,法等。,根据,标记不同,分：,免疫荧光技术：,免疫胶体金技术：,免疫酶标技术：目前最常用的方法。包括,PAP,法、,ABC,法、,SABC,法等。与免疫荧光技术比较，其优点定位准确、对比度好，染色标本可长期保存，适合光镜、电镜研究。,荧光标记免疫组织化学,直接法 间接法,免疫组织化学（荧光素标记）,毛细血管内皮细胞呈,vWF,阳性,血管性假血友病因子,Nucleus and Actin,Endoplasmic Reticulum,Nucleus and Microtubules,Actin and Microtubules,Cellular Structures,The Golgi Apparatus,Stages of Mitosis,酶联免疫组织化学,ABC,法：一抗生物素化二抗,abc,复合物,S-P,法,：一抗生物素化二抗,HRP,标记的链霉卵白素,免疫组织化学（辣根过氧化物酶标记）,大肠肌动蛋白,actin,阳性,4.,免疫组化技术的注意事项：,组织固定愈新鲜愈好。固定液多用,4%,多聚甲醛，固定时间不宜过长。,组织脱水必需彻底。,切片必需完整，平展，无气泡、皱褶。,切片贴附必需牢固：载玻片需做特殊处理。,切片脱蜡彻底。,4.,免疫组化技术的注意事项：,彻底抑制内源性过氧化物酶活性，降低背景染色常用抑制剂是,3%,的过氧化氢。,合理使用封闭剂，目的减少非特异性染色。封闭血清一般是和二抗同一来源，也可以用羊血清、小牛血清等，但不能与一抗来源一致。,抗原修复：,4.,免疫组化技术的注意事项：,选择合适抗体。,抗体使用注意事项。,PBS,的冲洗：,PBS,的要求：,PH 7.2-7.6,；浓度：,0.02M,。,单独冲洗,温柔冲洗,冲洗彻底,4.,免疫组化技术的注意事项：,DAB,显色注意事项：,DAB,是一种致癌物，严禁倒入水池，同时注意自我保护。,新鲜配制：显色前,10-15,分钟配制。,室温显色，需要在镜下控制显色时间，一般在,5-30,分钟。,洗涤剂清洗,泡 酸,临用前防脱处理,（明胶、多聚赖氨酸、,APES,）,流水冲洗,烤箱烤干,流水冲洗,蒸馏水冲洗,烤箱烤干,37,干燥备用,免疫组织载玻片特殊处理步骤,组织制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了部分抗原，,又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，导致免,疫组化染色过程中不能将其彻底显示，为了解决上述的,问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露或,修正的过程称为,抗原修复,。常用的抗原修复方法有,微波,修复法、高压加热法、水煮加热法、酶消化法,等，常用,的修复液是,PH6.0,的,mol/L,的柠檬树缓冲液。,抗原修复,一抗选择：选择单克隆抗体还是多克隆抗体。单克隆抗体特异性强，灵敏度较低；多克隆抗体特异性稍弱，灵敏度高，易出现非特异性染色。通过实验动物选择种属来源。能否做免疫组化。检测标本类型：石蜡切片、冰冻切片生产厂家：国内、国外。,二抗选择：根据一抗种属选择二抗种属来源 。,抗体选择,抗体保存：浓缩液于,-80,可保存三年左右。购买后，应在无菌条件下，将抗体分装成小包装，蜡膜密封。禁忌反复冻融。,选择最佳抗体稀释度：抗体稀释液用山羊血清、,BSA,或脱脂奶粉等。,抗体的加入：切片湿润，滴入抗体量以一滴,50ul,为好。,选择合适的孵育时间：,4,孵育过夜，室温,2,小时，,37 30-60,分钟。,抗体使用注意事项,必须设染色对照：,每批染色都要以特异性的阳性对照和阴性对照为基础，才能对染色结果做出正确的判断。,抗原表达必须在特定部位：,阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性，阳性细胞染色分布有三种类型：胞浆、胞膜、胞核。不在抗原所在部位的阳性表达一概不能视为阳性。,5.,免疫组化结果的判断原则,阴性结果不能视为抗原不表达：,即阴性结果不能认为具有否定意义；阳性表达有强弱、多少之分，哪怕是只是有少数细胞阳性（但要在抗原所在部位）也要视为阳性表达，不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。,免疫组化与,HE,切片诊断应以,HE,切片诊断为准：,当免疫组化诊断结果与,HE,切片诊断不一致时，应再结合临床资料、,X,线等影像学及实验室结果综合分析，不能用免疫组化检查结果推翻,HE,切片诊断。,所用的抗体特异性差,，与其它无关的抗原有交叉反应，特别是在应用多克隆抗体时更易出现。,抗体浓度过高或染色过程中切片干燥,，导致抗体与组织产 生非特异性结合。,出血和坏死：,红细胞的内源性过氧化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反应。,实验操作不当：,边缘效应；切片脱蜡不彻底；,PBS,冲洗不彻底；底物显色时间过长等。,假阳性出现的原因,抗体已失活、浓度过低；,组织自溶，抗原扩散而导致抗原消失,，特别在长期固定的标本中因抗原漏出而致假阴性，因此应多用新鲜固定之标本。,组织或细胞中抗原的含量很低，,所用的方法难以检测到，如用直接法检测为阴性，但改用间接法时则为阳性。,实验操作不当：,固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。,一抗孵育时间太短，或孵育温度太低。,缓冲液,pH,值不正确,假阴性出现的原因,五、组织学的学习方法,注意结构与功能的联系,建立立体与动态的概念,重视理论与实践的结合,Thanks!,