《基因组学》课件第10章 RNAi技术-2015

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十章,RNAi,技术的应用与发展,一、,RNAi,的发现,基因共抑制现象,一、,RNAi,的发现,线虫的,RNAi,现象,一、,RNAi,的发现,线虫的,RNAi,现象,RNAi,研究史,20,多年前，在对矮,牵牛花,（,petunias,）,进行的研究中发现协同抑制现象,cosuppression,，,导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制,。,96,年前后，研究发现 注入反义,RNA,及正义链,RNA,都能抑制,线虫,par-1,基因的表达；三年后，首次将双链,RNA,注入到线虫中,结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因,沉默效果,，,这种技术的成熟使得大规模筛选线虫,RNAi,诱导的功能缺失突变体成为可能，并引发后继的大量针对这种模式生物基因敲除的研究,。,在,果蝇,的研究中同样发现,RNAi,。,通过显微注射或者通过基因枪将,dsRNA,注入果蝇胚胎中能够引发基因沉默。在过去的几年中,RNAi,技术在果蝇的研究中成为一种反向遗传工具，用于鉴定功能缺失表型。,2001年,Elbashir,等,Nature,上首次报道通过21个核苷酸的,siRNA,成功地在,哺乳,动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。随后，在小鼠等多种细胞中也取得了成功。,RNAi,广泛发现于锥虫、拟南芥、水螅、涡虫、真菌、斑马鱼、果蝇、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的所有真核生物中。,在小鼠早期胚胎和大肠杆菌中也存在,RNAi,现象。在果蝇和线虫体内，,RNAi,可以达到基因敲除的效果,一、,RNAi,的发现,RNA,干扰,(RNA interference, RNAi),是指双链,RNA (dsRNA),分子引起的,序列特异性的,靶基因,mRNA,降解,阻止,mRNA,翻译，从而导致内源或外源靶基因,沉默,的一种机制。,RNA,干扰,( RNAi ),一、,RNAi,的发现,二、,RNAi,的发生机制,目前,RNAi,的作用机制主要是在线虫和果蝇生物体内被阐明的，后来研究发现它和植物的,共抑制,（,cosuppression,）、菌类的,静息,(quelling),作用有着共同的作用机理，都是,由同源转基因、,RNA,病毒和双链,RNA,等诱导产生的一种特定序列的,RNA,降解机制，其过程都由,起始、效应,和,倍增,三个阶段组成,。,二、,RNAi,的发生机制,起始阶段,效应阶段,生物体由于,RNA,病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录以及外源基因导入等原因产生了,dsRNA,分子。这些,dsRNA,在细胞内首先由一种类似,RNA,酶,(RNase),的酶,Dicer,切割为,21-25 nt,的小分子双链，正是这些小分子,dsRNA,直接诱导,RNAi,的发生，这种,dsRNA,分子被称为,小干扰,RNA,（,small interfering RNA,，,siRNA,）。,起始阶段,二、,RNAi,的发生机制,Dicer,是一种,ATP,依赖性内切酶,，在基因,Rde-1,编码的蛋白的帮助下,dsRNA,与,Dicer,结合，形成酶,-dsRNA,复合体，在,ATP,作用下，,Dicer,先将,dsRNA,解旋，接着将其切割成 有,2,个突出的单核苷酸的,21-23,个核苷酸小片段。,起始阶段,二、,RNAi,的发生机制,siRNA,与,RNAi,特异酶结合，形成一种能够特异降解与,siRNA,同源的靶,mRNA,的复合物，称之为,RISC,（,RNA-induced silencing complex,）。,siRNA,变性，双链解开，,RISC,激活,，,RISC,具有结合和切割,mRNA,的作用。,siRNA,的反义链通过碱基配对定位到同源,mRNA,上，,RISC,具有核酸酶的功能，在结合部位切割,mRNA,，切割位点即是与,siRNA,中反义链互补结合的两端。,-,在距,siRNA 3,端,12,个碱基的位置将靶,mRNA,切断，从而使目标,mRNA,降解。,效应阶段,二、,RNAi,的发生机制,效应阶段,二、,RNAi,的发生机制,切断后的,mRNA,或者被核酸外切酶所降解，或者可能成为,异常,RNA,，在,RNA,依赖性,RNA,多聚酶,（,RNA-dependent RNA polymerase,，,RdRp,）的作用下形成新的,dsRNA,，再次被,Dicer,识别并切断，形成新的,siRNA,进一步作用于另外的靶,mRNA,，,siRNA,通过这种方式大量扩增，从而使靶,mRNA,渐进性减少，导致目的基因沉默，呈现,RNAi,现象。,倍增阶段,二、,RNAi,的发生机制,倍增阶段,二、,RNAi,的发生机制,RNAi,作用过程用到两个关键的酶和复合体：,Dicer,RISC,二、,RNAi,的发生机制,RNAi,能够在多重水平上介导基因沉默。,转录后水平的基因沉默,转录水平的基因沉默,内源性基因沉默,二、,RNAi,的发生机制,二、,RNAi,的发生机制,高特异性,只降解与之序列相对应的,mRNA,，而其他,mRNA,的表达则不受影响,三、,RNAi,的作用特点,高效率,与反义,RNA,技术相比，,RNAi,技术在低于反义核酸几个数量级的浓度下，就能使目标基因的表达降到极低水平甚至完全抑制,可控性,研究基因功能时，与,T-DNA,和转座子技术相比，,RNAi,技术可以与细胞特异性启动子和可诱导系统结合使用，其抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的不同时期或不同器官中，有选择地进行。,可传递性,RNAi,抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持,在某些生物中,RNAi,还可以传递到后代中去。,三、,RNAi,的作用特点,RNAi,技术不仅可以特异性的抑制一个目的基因的表达，还可以同时,沉默同一基因家族,的多个基因，这是利用传统的基因突变的方法无法实现的。,四、,RNAi,研究的流程和方法,四、,RNAi,研究的技术方法,1. siRNA,序列设计,siRNA,（,small interfering RNAs,），,即小分子干扰,RNA,（,21-25bp,），是指为能够以同源互补序列的,mRNA,为靶目标并将其降解而介导,RNA,干扰途径的短片段双链,RNA,分子。,根据所选的,siRNA,序列的不同，可分为,编码区,RNAi,技术,启动子区,RNAi,技术,各自优缺点,四、,RNAi,研究的技术方法,1. siRNA,序列设计,编码区,siRNA,序列设计遵循以下原则,:,从,mRNA,的,AUG,起始密码开始寻找,“,AA,”,二连序列，并记下其,3,端的,19,个碱基序列，作为潜在的,siRNA,靶位点。,GC,含量在,30%,50%,左右。,将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列,/,EST,同源的序列。例如使用,BLAST.,选出合适的目标序列进行合成。,设置适当的,siRNA,对照,:,1),与靶定,siRNA,有相同的碱基组成，但排列完全不同，,且不与其它基因有同源性,AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG SN(G4,C5,A5,T6) ATTCGTGCTCAATGCAATCG NSN(G4,C5,A5,T6),2) 1-2,碱基错配的,siRNA,对照,(1-2nt),AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAG,T,TTAA,A,TCCTAG T,和,A,错配,四、,RNAi,研究的技术方法,1. siRNA,序列设计,四、,RNAi,研究的技术方法,1. siRNA,序列设计,NCBI,的,RefSeq,数据库中已有大鼠、小鼠和人类的全部基因的,siRNA,序列。,使用在线工具设计,siRNA,序列。,已经证实有效的,siRNA,序列也可以在网页中找到。,四、,RNAi,研究的技术方法,2. siRNA,的制备方法,化学合成法,体外转录法,RNase,降解长片段,dsRNA,siRNA,表达载体,siRNA,表达框架,四、,RNAi,研究的技术方法,2. siRNA,的制备方法,-,化学合成法,方便。,价格高。,由于价格比其他方法高，为一个基因合成,3,4,对,siRNAs,的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。,最适用于：,已经找到最有效的,siRNA,的情况下，需要大量,siRNA,进行研究；,不适用于：,筛选,siRNA,等长时间的研究，主要原因是价格因素,体外转录法,四、,RNAi,研究的技术方法,2. siRNA,的制备方法,-,体外转录法,四、,RNAi,研究的技术方法,2. siRNA,的制备方法,-,体外转录法,快，性价比高。,不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的,siRNAs,，但是反应规模和量始终有一定的限制。,最适用于：,筛选,siRNAs,，特别是需要制备多种,siRNAs,，化学合成的价格成为障碍时。,不适用于：,实验需要大量的、一个特定的,siRNA,。长期研究。,四、,RNAi,研究的技术方法,2. siRNA,的制备方法,-RNase,降解长片段,dsRNA,通常选择,200,1000,碱基的靶,mRNA,模板，用体外转录的方法制备长片段双链,RNA,，然后用,RNase (or Dicer),在体外消化，得到含有多种,siRNAs,的,“,混合鸡尾酒,”,。,由于,siRNA,混合物中有许多不同的,siRNAs,，通常能够保证目的基因被有效地抑制。,四、,RNAi,研究的技术方法,2. siRNA,的制备方法,-RNase,降解长片段,dsRNA,其他制备,siRNA,的方法的缺陷是需要设计和检验多个,siRNA,序列以便找到一个有效的,siRNA,。这种方法就可以避免这个缺陷。,缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。,最适用于：,快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型,不适用于：,需要一个特定的,siRNA,进行研究，特别是基因治疗,四、,RNAi,研究的技术方法,2. siRNA,的制备方法,-siRNA,表达载体,使用这类载体，需要,2,段编码短发夹,RNA,序列的,DNA,单链，退火，克隆到相应载体的,pol,启动子下游。,由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。,不过幸好载体容易大量扩增，这个优点足以弥补所有缺陷，特别是当载体在实验中确实有效的时候。,四、,RNAi,研究的技术方法,2. siRNA,的制备方法,-siRNA,表达载体,优点在于这是众多方法中唯一可以进行,长期研究,的方法,载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达。,最适用于：,已知一个有效的,siRNA,序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达,siRNA,的细胞。,长期研究,。,不适用于：,筛选,siRNA,序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）,四、,RNAi,研究的技术方法,2. siRNA,的制备方法,-siRNA,表达框架,siRNA,表达框架,(siRNA expression cassettes,，,SECs),是一种由,PCR,得到的,siRNA,表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。,siRNA,表达框架包括一个,RNA pol,启动子，一段发夹结构,siRNA,，一个,RNA pol,终止位点。,SECs,为筛选,siRNA,的最有效工具。,四、,RNAi,研究的技术方法,如果在,PCR,两端添加酶切位点，那么通过,SECs,筛选出的最有效的,siRNA,后，可以直接克隆到载体中构建,siRNA,表达载体。,构建好的载体可以用于稳定表达,siRNA,和长效抑制的研究。,最适用于：,筛选,siRNA,序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子；,不适用于：,长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了） 。,2. siRNA,的制备方法,-siRNA,表达框架,四、,RNAi,研究的技术方法,四、,RNAi,研究的技术方法,四、,RNAi,研究的技术方法,3. siRNA,的导入,磷酸钙共沉淀,电穿孔法,葡聚糖法,机械法,脂质体介导法,五、,RNA,干扰效果的检测,可从,mRNA,和蛋白质两方面进行。,mRNA,：,RT-PCR,；定量,PCR,；,Northern,杂交等。,蛋白质：,Western,杂交；,ELISA,；免疫荧光等。,细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数的变化是,RNAi,效果最终和最大的体现。,六、,RNAi,的应用,1.,在功能基因组中的应用,2.,在基因治疗中的应用,六、,RNAi,的应用,1.,在功能基因组中的应用,由于,RNAi,具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此,RNAi,可以作为一种研究基因功能的强有力工具，用于功能基因组的研究。,将功能未知的基因的编码区（外显子）或启动子区，以反向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转录出的,RNA,可形成,dsRNA,，产生,RNA,干扰，使目的基因沉默，进一步研究目的基因的功能。,研究基因功能的新工具。,目前开发的湿性老年黄斑变性病的治疗药物,“,贝伐西尼（,Bevasiranib),”,为,一种,siRNA,，其可选择性地作用于血管内皮生长因子,(VEGF),，诱导新血管形成以抑制,VEGF,的表达，,并通过了三期临床试验。此外，目前正在研发含有靶向多种基因的,siRNA,的治疗药物。,六、,RNAi,的应用,2.,在基因治疗中的应用,六、,RNAi,的应用,2.,在基因治疗中的应用,六、,RNAi,的应用,六、,RNAi,的应用,2.,在基因治疗中的应用,治疗,HIV,感染,针对,HIV,病毒研究有,Jacque,等设计的抑制,HIV 1,长末端重复序列、附件基因,vif,和,nef,表达的,siRNA,，,Lee,等针对,rev,转录子设计的,siRNA,及,Novina,等针对,HIV,病毒,gag,基因设计的,siRNA,，其基本策略都是选择,HIV,病毒或宿主细胞基因为靶点。,六、,RNAi,的应用,2.,在基因治疗中的应用,治疗病毒感染,合成靶向,HBV,基因组不同部分的,2,种,siRNA,并分别与表达载体连接后导入感染,HBV,的小鼠。结果发现治疗组小鼠体内肝炎病毒,RNA,的数量与对照组相比减少了,92%,。治疗组小鼠没有发现严重的副作用。,将合成的针对,HCV,基因组的,siRNA,导入人肝肿瘤细胞系中，使病毒特异性蛋白表达和,RNA,合成降低,90%,，,RNAi,效应持续超过,72,小时。使用,RNAi,载体可使,RNAi,效应持续,3,周以上。,六、,RNAi,的应用,2.,在基因治疗中的应用,治疗肿瘤,多种癌基因可以作为靶点设计相对应的,siRNA,。,对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。,Scher,等以引起慢性髓性白血病和,bcr ab1,阳性急性成淋巴细胞白血病的,bcr ab1,癌基因为靶基因,设计了对应的,siRNA,并获得了,87%,的有效抑制率。,Wilda,等用,siRNA,抑制白血病,bcr/abl,融合基因表达也取得了成功。 因此基于,RNAi,技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大。,思 考 题,1.RNAi,的作用机制是什么？,2.RNAi,有哪些特点？,3.siRNA,的制备方法有哪些？,4.,举例说明,RNAi,的应用。,