HPLC保养和故障排除

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,Mastertitelformat bearbeiten,Mastertextformat bearbeiten,Zweite Ebene,Dritte Ebene,Vierte Ebene,Fnfte Ebene,HPLC,的保养和故障排除,1,HPLC,的日常操作条件,最好是恒温、恒湿,温度：,1,5,30,相对湿度,80%,房间应有良好的通风,空调或其他设备产生的气流不要直吹仪器,避免光线直射,远离高电干扰、高振动设备,泵的使用与维护注意事项,防止任何固体微粒进入泵体（,0.2um,或,0.45um,的微孔滤膜过滤）,流动相不应含有任何腐蚀性特质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内,泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、密封圈，最终产生漏液,输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力,流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性,流动相的选择,采用 “,HPLC”,级溶剂,对试样有适宜的溶解度,溶剂粘度要小,与检测器相匹配,溶剂的等级,HPLC,级,优级纯,分析纯,溶剂等级,微量分析、梯度洗脱,都经过蒸馏和,0.45u,的过滤,(,除纤维毛,未溶解的机械颗粒,),优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC,级经过,0.2u,的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,溶剂纯度的影响,溶剂中的杂质会导致出现“鬼峰”，特别是梯度解吸时,注意： 只能使用色谱级的溶剂,!,不能使用旧的或未经过滤的缓冲溶液,缓冲液的使用,缓冲液的使用,使用前必须过滤,使用后一定要进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损、阻塞,:,第二天接着用：用,20%,甲醇：,80%,水冲洗,20-30,分钟,隔几天再用：用甲醇：水冲洗后，再用纯甲醇冲洗,易受到细菌和霉菌的影响,不能直接用有机溶剂冲洗,流动相的过滤,过滤：0.45um,或更小孔径滤膜,目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其在使用无机盐配制的缓冲液时,过滤膜种类,水系过滤膜,水系滤膜严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解,有机系过滤膜,脱气,目的：除去流动相中因溶解或混合而产生的气泡,产生原因：,温度上升,压力下降,溶剂混合,流动相的脱气,流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯容器中，不能贮存在塑料容器中。,容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。,磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应临用现制。,容器应定期清洗，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。,流动相的贮存,流动相过滤头产生的问题,故障特征,“鬼峰”,(,由已被污染的过滤头造成,),保留时间不断改变,(,由于过滤头堵塞或部分堵塞,),清洗步骤：,1.,水,2.,稀硝酸,3.,水,4.,异丙醇,5.,水,(,超声波清洗,),流路中形成气泡引起的问题,改变保留时间和峰面积,流动相中形成气泡对液流的不良影响,泵中形成气泡使液流波动,峰变形,柱中气泡形成和累积使流动相绕流,尖峰或锯齿状噪声,检测池中气泡形成和累积产生基线噪声,1.,使用流动相溶解样品,-,减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要,-,保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀,2.,进样前最好使用,0.45um,的膜进行过滤,如果样品很脏，要使用,0.2um,的膜进行过滤,样品处理,梯度洗脱,优点,：,可提高分离度、缩短分离时间和提高分离精度,注意事项：,溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差,，进行样品之前必须进行空白梯度洗脱 ，以辨认溶剂杂质峰。,梯度混合的溶剂互溶性要好,梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）,每次梯度洗脱之后要对色谱柱进行充分的平衡。,梯度洗脱,溶剂混合产生的问题,流动相中所使用的不同溶剂必须互溶,流动相中溶剂不互溶会导致,:,1.,基线漂移，,2.,保留时间的重现性差，,3.,出现肩峰和“鬼峰”的问题,.,混合器,低压梯度比例阀,高压梯度,低压梯度,脱气机,高压,/,低压梯度系统,高压梯度系统,梯度准确度好,系统复杂,(,需两台或三台泵,),低压梯度系统,系统简单,需在线脱气机,存在时间滞后效应,高压,/,低压梯度系统,输液泵发生故障及相应排除措施,故障,可能原因,解决办法,无流动相流出，,又无压力指示,泵内有大量气体,打开泄压阀，以较大流量（,5,mL/min),运转，,密封圈损坏,更换,压力和流量不稳,有气泡,打开泄压阀，以较大流量（,5,mL/min),运转，,单向阀内有异物,稀硝酸超声清洗,压力高,堵,压力低,漏,手动进样器,操作注意点：,1）,样品溶液必须用,0.45um,的滤膜过滤,2）,进样时，进样针应插到底,，,不使用时将针头留在进样器内,3）进样应使用液相色谱专用平头进样针,4）,转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置,5,）,样品溶液,pH,小于,10, 常用密封垫的材质适用pH10, 否则换特氟隆材质的密封垫pH10-13,定子,转子,针头密封垫,弹簧,不锈钢套,进样器的保养,进样器的保养,进样体积,过大的进样体积会导致产生,宽峰或峰形不对称,通常引起色谱柱过载或超出检测器的检测限是由于样品浓度过高而不是体积的问题,注意： 使用微径柱时，必须保证柱子不要过载,柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动,柱的保养,8,9,4,5,6,1,2,3,7,0,xxxx,xxxx,xxxx,xxxx,xxxx,xxxx,xxxx,xxxx,xxxx,000 0,000 0,LC-10AD :,输液时不要打开排液阀,当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净,要注意流动相的脱气,避免使用高粘度的溶剂作为流动相,进样样品要提纯,控制进样量,每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品,每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱,当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存,柱的保养,噪音高或基线漂移,解决问题,可能原因,柱子没有平衡好,杂质组分从色谱柱中缓慢流出,杂质在柱子中的富集,检测器或色谱柱的温度差异,系统有气泡,检测器氘灯需更换,电压不稳造成干扰,解决办法,继续冲洗色谱柱至平衡,利用强极性的溶剂冲洗色谱柱,冲洗色谱柱；提高样品的预处理；,使用色谱纯的溶剂,使用色谱柱恒温箱,流动相脱气；,更换氘灯,使用稳压电源；检查供电系统,出现“鬼峰”,解决问题,可能原因,上一针样品中没有,完全流出的物质,色谱柱被污染,溶剂中有杂质,流动相和溶解样品,的溶剂不互溶,解决办法,待样品中的组分尽可能完全流出后才进下一个,样品；每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲,洗色谱柱；改进样品的预处理,每运行完一个样品后用强极性的溶剂冲,色谱柱；改进样品的预处理,使用色谱纯的溶剂,尽量用流动相溶解样品；,出现肩峰或,前延峰,解决问题,可能原因,柱头“塌陷”造成死体积,溶解样品的溶剂选择错误,干扰物质的存在；,样品中的杂质,色谱柱过载,柱外效应的影响,解决办法,更换色谱柱,用流动相溶解样品,改进样品预处理；,使用色谱纯溶剂,将样品稀释,检查管路连接,峰形展宽,解决问题,解决办法,更换色谱柱或预柱,减少进样体积；稀释样品,用流动相溶解样品,检查管路连接,检查是否有漏；使用小的检测池,提高色谱柱温度,更换色谱柱,可能原因,色谱柱或预柱被污染或不合适,色谱柱“过载”或进样体积过大,溶解样品的溶剂选用不当,柱外效应的影响,色谱柱和检测器之间有漏；,检测器的检测池过大,色谱柱温度太低；,流动相的黏度太高,色谱柱柱效下降,出现脱尾峰,解决问题,解,决办法,减少样品体积；,改进样品预处理；,调节流动相的组成；,使用流动相改性剂（如三乙胺）；,降低流动相的,pH,值；,使用碱性去活的色谱柱,更换滤网；使用柱前过滤系统；,将样品过滤,检查管路连接,更换色谱柱；,可能原因,色谱柱过载,干扰峰；杂质,硅胶表面未完全键合的,硅羟基的影响,色谱柱的滤网堵塞,柱外效应的影响；,死体积,色谱柱有“塌陷”、短流或断流,出现双重峰或,分叉峰,解决问题,可能原因,样品体积过大；,色谱柱过载,溶解样品的溶剂选用不当,色谱柱有“塌陷”、短流或断流,色谱柱滤网堵塞,进样器没有彻底清洗,解决办法,减少进样体积；,稀释样品；,将样品在流动相中溶解,更换色谱柱；,使用较温和的分离条件,更换色谱柱的滤网；,使用柱前过滤装置；,过滤样品,彻底清洗进样器；,更换进样器转子,保留时间变长,解决问题,可能原因,流速降低,硅胶表面有活性点,键合相流失,流动相的组成有变化,温度降低,解决办法,检查系统是否有漏；,更换泵的密封圈；,排净气泡；,使用流动相改性剂（如加入三乙胺）；,使用碱性去活的色谱柱,保持流动相,pH,值在,2-7.5,范围内,检查泵；检查滤网；,防止流动相的挥发或降解,使用色谱柱恒温箱,保留时间缩短,解决问题,可能原因,流速升高,色谱柱过载,键合相流失,流动相组成发生变化,温度升高,色谱柱老化,解决办法,检查泵；检查流速,降低样品的浓度或进样体积,流动相的,pH,值保持在,2-7.5,范围内,检查泵；检查滤网；,防止流动相的挥发或降解,使用色谱柱恒温箱,更换色谱柱；,使用预柱,保留时间,无规则改变,解决问题,可能原因,流速发生变化,色谱柱尚未平衡；,流动相组成发生变化；,流动相中的溶剂互溶性差,色谱柱温度发生变化,杂质在色谱柱中“堆积”,解决办法,检查是否有漏；,更换泵的密封；,排净气泡,至少用,10,倍柱体积的流动相,平衡色谱柱；,检查泵；检查滤网；,防止流动相的挥发或降解,使用色谱柱恒温箱,冲洗色谱柱；,检测器的保养,紫外灯的保养：分析前，柱平衡差不多时，打开检测器；在分析完闭后，先关紫外灯。（频繁的开关灯会缩短灯的使用寿命）,样品池要保养,1,）用,HPLC,级溶剂,2,）过滤流动相和溶剂,3,）脱气,4,）不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中,