肿瘤细胞培养技术-林星石

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,肿 瘤 细 胞 培 养 技 术,1,Histroy,肿瘤类型：,间充质 上皮 神经外胚层,造血源性,（1955-1958-1963-1965）,In vitro:,原代 传代 建系,（1967-1970）,配基成分：,纯血清 含血清 无血清,生物学特性：,细胞 亚细胞 酶和分子,2,肿瘤细胞,in vitro,的特点,细胞保持永生性：,自我复制,形态学：,大小不一,逐渐一致,增殖力更强：,DNA,合成期、分裂期达50%,突变性：,不同于正常细胞，失去稳定的控制高分化,变低分化,表面性状：,负电荷数量正常，贴壁性,，抗原性可,变异,接触抑制减弱或消失：,悬浮生长特征：,成瘤性：,移植到动物体内可成瘤,3,肿瘤细胞in vitro 培基,RPMI1640：,最常用，,+10,20%FCS，上皮性,或悬浮性（+0.03%谷氨酰胺）,DMEM,：,常用,F12：,适用于上皮性癌，如肝癌，,L-15：,注意：+2g/L NaHco,3,或,+20mmol/L HEPES,pH7.2,RPMI1640+F12或L-15（1:1）：,适用肉瘤,4,培养液特殊添加剂,常用的促,细胞生长因子及使用的终浓度,添加剂 终浓度 添加剂 终浓度,BSA 10,-5,mol/ml EGF 5ng/ml,transferrin 5-10,g/ml,FGF 5ng/ml,insulin 5 pg/ml NGF 5ng/ml,氢化可的松 10,-5,mol/ml,5,肿瘤细胞的培养,与常规细胞培养技术相同,一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性,建株细胞较正常细胞易于培养,6,细胞分裂增殖的调控（细胞周期）,多种基因的协同作用,调控因子：,基因：Cdc2、 cyclin,蛋白磷酸化,蛋白激酶的调控,胸苷激酶的调控,负调：DNA损伤与DNA修复：抑制抗性,肿瘤细胞,7,细胞间的相互影响,不同亚群代表不同分化程度的细胞群,表型、形态、受体、对因子的反应等,均不同,不同亚群释放不同的正负调节因子,(阴阳调控),8,细胞因子与激素对肿瘤细胞的调控,一个重要而复杂的因素,因素 高分化 低分化,胰岛素 生长 -,凝血孝素 生长 -,前列腺素 促进（400) 抑制,激情素 - 助黏附,维生素A 抑制生长及分化,_,调整培基中的成分可调控细胞的生长与分化,9,影响培养肿瘤细胞生长的因素,PH,营养：如血清效价低,细胞生长因子的自分泌及旁分泌,癌基因抑癌基因的变化,排泄废物的影响,细胞外基质的作用,细胞相互间的作用,污染,10,培养技术 - 取材,手术标本,活检标本,胸腹水穿刺,细针头穿刺,内窥镜活检,关键：新鲜、无菌、及时、准确,11,技术- 分离纯化,分离：,剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等,密度沉降分离,纯化：,反复贴壁去除成纤维细胞,自然淘汰去除正常细胞,利用特异抗原标志筛选法( panning) 分亚型,流式细胞仪分选,克隆建株,高转移株的建立：反复接种,12,技术-培养,原代培养：,去除纤维细胞及淋巴细胞，,防止细菌、真菌污染。,传代培养：,增殖力低的细胞需要饲养,细胞适当密度, 基本长满后,传代, 前10代不稳定，注意,培养条件，适当调整培基。,13,技术- 鉴定与建株,鉴定：,组织来源 、形态特征、核型染色体分析、生长特性、对细胞因子的反应（TNF)、集落形成、致瘤实验（裸小鼠）,建株：,生长半年以上，病理诊断、光镜及电镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、致瘤及转移情况,注意：,不是每一肿瘤组织都能建株,14,应用- 肿瘤治疗的研究,治疗药物敏感性的鉴定与筛选,肿瘤的多药耐药性的鉴定,各种新药治疗的实验研究,体外：,肿瘤的生长（,3,HTdr掺入）,肿瘤的杀伤率（MTT、,51,Cr释放）,体内：,裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤,生长率、转移率、生存时间及死亡率,作用机理的研究：,基因、蛋白、酶、标志、受体,15,肿瘤细胞培养的应用,肿瘤细胞的遗传特性：,各种癌基因及抑癌基因的分析、染色体定位（FISH法）,肿瘤细胞的生物学行为：,细胞周期（FACS)、信号传递,肿瘤细胞的标志与激素、受体变化,（免疫细胞化学、放射自显影、酶免疫、荧光免疫、放射免疫、免疫印迹）,16,17,单克隆抗体的制备,18,单克隆抗体的制备,基本原理：,Bunet,抗体选择学说，每个B细胞只能够产生一种针对它的特异性抗原决定簇的抗体。从一个祖先B细胞分裂繁殖形成的纯细胞系，称为克隆。,19,单克隆抗体的制备,单克隆抗体定义：来自克隆系的细胞基因完全相同，产生的抗体完全相同。这种从一株克隆系产生的抗体 单克隆抗体（McAb)。,1975年,Kohler,和,Milstein,首先利用细胞融合技术制备了永久分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。,20,单克隆抗体的制备,特点：,肿瘤细胞易体外培养和长期生长；,B淋巴细胞 分泌特异性抗体；,二者杂交融合杂交瘤，继承二者性质。,HAT培基：,H,次黄嘌呤、,A,氨基蝶呤,T,胸腺嘧啶核苷,21,单克隆抗体的制备,肿瘤细胞DNA合成途径：,叶酸衍生物,氨基酸、小分子化合物合成DNA,HGPRT -,TK,次黄鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,胸腺嘧啶核苷激酶,核苷酸前体,22,单克隆抗体的制备,HAT特点：“A” 叶酸拮抗物,骨髓瘤-骨髓瘤：,DNA合成途径阻断；缺HGPRT，,不能利用“H”死亡。,脾细胞-脾细胞：,有HGPRT，缺增殖能力死亡。,骨髓瘤-脾细胞：,HGPRT+无限增殖能力 存活。,23,单克隆抗体的制备方法,抗原：,纯度、分子量。,1.,细胞12,10,7,2. 可溶性蛋白质抗原10,100,g,动物：,BALB/C鼠，周龄：68周，雌性,佐剂：,福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、脂质体,24,免 疫 方 法,1.常规免疫：,腹腔或颈部多点皮下,0 天：,基础免疫抗原+完全佐剂,15天：,基础免疫抗原+不完全佐剂,30天：,基础免疫抗原+不完全佐剂,45天：,追加免疫同量抗原,48天：,进行细胞融合,25,免 疫 方 法,备注：,1. 细胞、细菌、病毒等颗粒性抗原有较强抗原性，可不加佐剂，直接腹腔注射。,2. 可溶性蛋白质抗原需加佐剂。,本研究室经验：,26,免 疫 方 法,2. 脾内免疫：,2.1,0 天：基础免疫,15 天：脾内免疫,18 天：细胞融合,2.2,0 天：脾内免疫,4 天：细胞融合,27,免 疫 方 法,脾内免疫,优点：,时间短，使用抗原量少。,可溶性抗原：210,g,细胞抗原：1,10,5,缺点：,效果差于常规免疫，尤其无基础免,疫的脾内免疫。,28,免 疫 方 法,脾内免疫方法：,BALB/C小鼠乙醚麻醉，右卧位，消,毒，无菌操作剪开皮肤，透过腹膜，用 4,号针头注射器注入脾脏，尽量刺深，勿刺,透，纵轴方向，边退边注射或多点注射。,注意事项：,抗原体积,0.2 ml，脾内逐步注射后，,针头拔出口时要停留片刻， 缝合切口或用,医用黏合剂涂抹切口。,29,免 疫 方 法,3 . 弱免疫原免疫方案；,0 天：基础免疫,30 天：基础免疫,45 天：基础免疫,60 天：基础免疫,75 天：基础免疫,6个月内，至鼠血清测出抗体产生。静脉,或脾内追加免疫后7296h细胞融合。,30,免 疫 方 法,4. 体外免疫：,分离小鼠脾细胞，置 10% 20% FCS,RPMI1640培基，加适量滋养细胞与抗原,（可溶性抗原 0.5 5,g/ ml；细胞性抗原,10,5,10,6,/ ml），37，5%CO,2,培养 3 天，,再分离淋巴细胞与骨髓瘤细胞，融合。,31,单 克 隆 抗 体 制 备,一.滋养细胞制备：,1. 机制：,不明，通常认为这类细胞释放,一种或几种生长因子，提供必要生长,条件。,2. 小鼠腹腔巨噬细胞制备滋养细胞,正常无感染BALB/C小鼠，处死。,75%乙醇浸泡 510min，,32,单 克 隆 抗 体 制 备,撕开腹部皮肤， 充分暴露腹腔， 提起,腹膜，剪开，吸管注入5 ml无血清培基，,小心提动或轻揉腹膜， 吸出培基。,无血清培基洗2次，细胞浓度210,5,/ml,0.1 ml / 孔/ 96孔，相当于 210,4,。通,常获210,6, 510,6,只。,33,单 克 隆 抗 体 制 备,二. 骨髓瘤细胞准备：,Sp2/0, NS-1等,1.,复苏，20%FCSRPMI-1640培基为好。,2.,培养、传代，取对数生长期细胞（110,5, 5 10,5,/ml），按1：5 1：10,稀释传代，2、3天扩大培养，选生长状态、形态好对数生长期细胞融合用。,3.,RPMI-1640培基洗3次（1000r/min 5min ),34,单 克 隆 抗 体 制 备,注意事项：,1.,骨髓瘤细胞的细胞活数应在95%，,2.,无各种污染，,3.,骨髓瘤细胞质量保证、生长密度合适。,35,单 克 隆 抗 体 制 备,三. 免疫脾细胞悬液制备：,1.,免疫BALB/C鼠，放眼血致死（收集眼血制成血清）。,2.,浸泡于75%乙醇515分，入超净台，打开腹腔（逐次换器械），取脾。,3.,剪碎脾脏，注射器内芯研磨过100目钢筛，,平皿预先23ml RPMI-1640，移入圆底试管，补加适量培基，静置35分，取上2/3悬液移入50ml离心管，上述反复23次。,36,单 克 隆 抗 体 制 备,三. 免疫脾细胞悬液制备：,5.,上述培基洗细胞2次（ 1000r/min 10 min ），,6.,不完全培基10ml重悬液，台盼蓝计数活,脾细胞数，1 10,8, 2.5 10,8,/只。,37,单 克 隆 抗 体 制 备,四. 50%PEG的准备：,融合前，称PEG（mw = 4000) 2g，置小,瓶内，低压消毒（8磅），15min,取出立即,边加边摇加入2ml完全培基，（内含0.3%ml二,甲基亚枫，以提高融合率），至完全混合，4,保存。用前37 预热。要求PEG现配，防止,PH变碱。,38,单 克 隆 抗 体 制 备,五. 细胞融合：,1.,将准备好的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于,50ml离心管内（脾细胞1 10,8,，骨髓瘤细胞1 10,7,）。用SP2/0时，脾细胞：骨髓瘤细胞以10：1为好；用NS-1，脾细胞：骨髓瘤细胞以5：1为好。,39,单 克 隆 抗 体 制 备,2.,RPMI-1640培基洗2次（1500r /min/8min）；,3.,倾倒上清，吸尽残留液，轻弹管底， 使细胞,疏松，离心管移至超净台预先放置的37,水浴。,4.,1 ml 吸管吸取 0.8 ml,37, PEG，1,10,8,脾细胞+,0.8 ml PEG，边加边摇，60s内加完，,轻摇1.5,min。5,min内,摇动缓和,加入10,ml 预,温37,的RPMI-1640。,40,单 克 隆 抗 体 制 备,注意：,第1 min 加 1 ml;,第2 min 加 1 ml;,第3 min 加 1.5 ml;,第4 min 加 1.5 ml;,第5 min 加 5 ml; 再补加40 ml。,离心：1000r / min / 5min.,41,单 克 隆 抗 体 制 备,5.,移出上清，取少量HAT小心吹散细胞，细,胞移入HAT培基中，按免疫脾细胞,210,5,/ 孔/96孔，,加入 0.1 ml 0.2 ml/孔（已加入融合当天,制备的滋养细胞）， CO,2,孵箱 37,。,提示：,接种1012块96孔板，使80%杂交瘤生长为,单克隆，减少克隆化次数，阳性孔不易丢失。,42,单 克 隆 抗 体 制 备,六. 融合细胞观察与换液：,1.,第23天骨髓瘤细胞退化、核缩、碎裂，,增生、吞噬碎片；,第45天可见小堆,杂交瘤细胞生长。记录。,2.,融合后57天确认骨髓瘤细胞全部死亡，,毛细吸管吸出0.1ml 0.15ml HAT，,换成同量HT培基。,43,单 克 隆 抗 体 制 备,七. 杂交瘤抗体检测：,培基变黄，杂交瘤细胞占孔底面积1/4、状,态好，可测上清液抗体（非分泌性比分泌性杂,交瘤长速快），及时测抗体及时克隆化，以免,目的杂交瘤丢失。,测定时间：融合后1015天，第次换液3,天后，ELISA、冰冻切片荧光技术等。,阳性孔杂交瘤转入24孔板，1天后细胞状态,好即可克隆化。,44,单 克 隆 抗 体 制 备,八. 克隆化：有限稀释法。,1.,按前述准备新鲜滋养细胞用,HT培基接种 96,孔板，,0.1ml/孔。,2.,向24孔板加0.9 ml/孔HT，通常每个待克隆杂交瘤需34孔。,3.,用1ml吸管吹散待克隆的杂交瘤细胞，取适量加入含,0.9mlHT24,孔板第孔，混匀，吸,0.1ml,加入第孔，同法稀释第,3孔、第4孔。,4.,混匀第,1,孔细胞计数。,45,单 克 隆 抗 体 制 备,5.,计数后从相应孔取,100,个细胞（如第,3,孔细胞,计数为,1.210,3,，则从第,3,孔取,100/1.2,10,3,0.083ml,），加入,10ml HT,，接种预先加入滋,养细胞,96,孔板，,0.1ml,/孔，每孔约,1,个杂交瘤细,胞，总量,0.2ml,/孔。,6.,910天,测抗体，阳性孔转,24,孔板，,13,天后,第2次,、,第3次,克隆，直至阳性率,100%,。,7.,克隆化后,HT,逐渐换成,RPMI-1640,，,1/2,递减,FCS,浓度递减,5%至10%15%。,46,8.,细胞冻存：阳性杂交瘤尽早冻存。,24孔,板阳性孔应再分出,1,孔，待第,2,孔,生长良好，长满孔底，收集第,2,孔细,胞冻存。, 建株后每株冻存,58,管。,47,单克隆抗体免疫学测定,1.,Ig单克隆抗体亚型测定,2. 单抗对应抗原特性分析：理化性质、,分子量。,3. 单抗等电点测定,4. 单抗亲和力测定,48,