05 微生物农药(讲义5）

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 微生物农药,一、概述,1 概念与定义,即传统概念上的生物农药，而且主要是指杀虫的微生物。,现代概念的微生物农药是指以活体微生物或者以微生物的代谢产物来作为农药，不仅是指杀虫活性，还包括杀菌、除草和植物生长调节活性等。,微生物农药的概念可进一步扩展，定义为用来防治病、虫、草等有害生物的微生物活体及其代谢产物和转基因产物，并可以制成商品上市流通的微生物源制剂,。,因此按功能作用来分，有杀虫、杀菌、除草和植物生长调节剂4大类；按有效成分分为：抗生素类、细菌类、真菌类、病毒类、原虫类、线虫类、微生物产生的植物生长调节剂类等七大类。,转微生物基因的植物，应该视为活体的植物农药，但活性成分是来自于微生物的。,线虫，有人也把这类动物列为微生物农药，实际上线虫是属于动物类的。动物界的线虫门，有4万多种，1981才有人提出应用线虫防治害虫，因此，研究比较少。,原虫，又叫原生动物，是单细胞动物或有单细胞组成的群体。传统上属于动物界，1980年以后属于原生生物界的一个亚界。也可以看成是微生物，目前有3-4万种，寄生在昆虫体内的就有1500多种，如锥虫、滴虫、变形虫、微孢子虫等。,从已上市的生物制剂对防治目标对象的作用机理来看，微生物农药最终起作用的物质根本都为具有一定化学结构的生物化学物质，如Bt和抗虫棉的(内毒素蛋白，白僵菌的白僵素，病毒分泌的酶，以及防治病虫草害的抗生素和植物生长调节剂等，都具特定的化学结构。,按扩展概念来计算，我国微生物农药的产量或防治面积已占农药总产量或防治面积的l0左右，如井冈霉素一个品种的年产量(100有效成份04万吨)，就占杀菌剂总产量(45万吨)的9左右，加上其它品种如阿维菌素、赤霉素、Bt、农抗120、多氧霉素、白僵菌及一些病毒制剂的产量，它们占农药总产量的比例已接近l0。,2 微生物农药的,特点,1对人畜平安、对病虫害的特异性强，不杀伤天敌和有益生物；,2易被其它生物或自然因素所分解破坏，在环境中不易积累，对使用环境的污染少；,3作用效果一般比较缓慢，作用机理比较复杂，常常有多种因素和成分发挥作用，害虫和病原物难以产生抗性。,4可进行规模化生产，生产原料大多为农副产品，来源广，易生产；,5各种品种生产工艺相似、设备相同，建一个工厂就可生产多品种。,6可利用现代生物技术和基因工程技术对微生物和毒力基因进行改造，不断改进性能和提高质量。,3 细菌类微生物农药,我国对以Bt为主的细菌类农药品种的研究开发，一直比较活泼。如对Bt，除研究其作用机理、发酵工艺外，还研究Bt的工程菌和转Bt杀虫基因的植物。目前Bt制剂的生产厂家已达64家，年产量8万多吨制剂，年应用面积到达5千万亩次以上；转Bt基因的农作物并产业化的品种已有抗虫棉和抗虫玉米、水稻等，年推广应用面积到达300万亩左右。,除Bt外，开发成功的细菌制剂还有亚宝(枯草杆菌)、力宝(假单胞杆菌)、增产菌(蜡质芽胞杆菌)、康地蕾得多粘类芽孢杆菌等。,4 病毒类农药,我国病毒资源丰富，“七五、“八五期间研究出了十几株具有较好开发应用前景的病毒株，其中棉铃虫核多角体病毒已登记注册，并形成年产百吨制剂的生产线，“九五期间注册登记了斜纹叶蛾多角体病毒和粘病毒，使用面积每年到达百万亩以上。,2002年，武汉大学生命科学学院与武大绿洲生物技术合作，研制成功的6个“武大绿洲菜园系列病毒杀虫剂，分别是菜青虫、小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、苜蓿银纹夜蛾的颗粒体和核多角体病毒,利用生物工程技术获得的基因修饰及含有增效蛋白因子的病毒株系已处于开发生产阶段，从而使昆虫病毒产品的作用谱更广、防治效果更好。,5 真菌类微生物农药,昆虫病原真菌有700多种，而其中只有10余种用于害虫防治。目前，已经有50多个真菌杀虫剂品种。,我国开展真菌制剂的研究开发已有,30,多年的历史，其中以白僵菌为最。,目前虽然还未开发成功白僵菌制剂产品，但每年应用白僵茵防治松毛虫和玉米螟等的面积达,1000,万亩次以上。,本霉菌已开发成功，取得农药登记注册，用于防治蔬菜灰霉病具有较理想的效果和应用前景主要有哈次木霉T. harzianum对立枯病、菌核病等有效)。,目前，处于小试和中试阶段的真菌制剂还有绿僵菌(防治蝗虫)，淡紫拟育霉(防治植物线虫)、毒力虫霉(防治蚜虫)和蜡蚧轮枝菌(防治白粉虱)等。,球孢白僵菌的研究也取得很大进展，主要是增强了球孢白僵菌侵染昆虫体壁过程中降解昆虫体壁蛋白酶和几丁质酶的能力。,6 微生物产生的植物生长调节类农药,我国开展植物生长调节剂研究的历史可追溯到50年代初，从5406细胞分裂素土法生产到赤霉素的开发成功和大面积应用，说明植物生长调节剂在我国农业生产中发挥了重要的作用。,特别是赤霉素促进双季杂交水稻的分蘖、齐穗、早熟的作用，使其需求量急增，生产厂家到达40多个，成为植物生长调节剂中的当家品种。,目前开发成功的由微生物产生的植物生长调节剂品种还有细胞分裂素、脱落酸等。,8 微生物除草剂,比较复杂，现在人们的概念是可以象农药一样防治特定的农田杂草的微生物。,现在已经在国外广泛应用的微生物除草剂已经有10多种，但从登记的情况来看，主要是微生物的代谢产物，如：Fusarium solani,主要是用来防治大豆和棉花田的除草剂,我国1963年即开发出真菌黑盘孢目炭疽病属鲁保一号，防治菟丝子；1978年利用链霉菌新种筛选出的农抗除草剂A和B，具有选择性除草和高效防治水稻白叶枯病的双重作用。,微生物杀虫药剂,活体微生物杀虫剂主要包括,：,1,细菌性杀虫剂概述,昆虫病原细菌根据它们的寄主的专一性和作用的特殊方式而分为三种类型：,专性病原菌,是一类专性寄生的芽孢杆菌，在自然界，只在寄主昆虫体内繁殖，对特定的昆虫寄主有很强的致病力，经消化道易传染。芽孢杆菌的金龟子乳状病原菌和梭状芽孢杆菌属细菌就属于这一类。,兼性病原菌,这是一类营腐生生活，也可寄生于昆虫体内的病原细菌，它们的寄主范围较广。细菌在昆虫宿主消化道内增殖，并侵入消化道内，造成寄主染病死亡。,潜在病原菌,多数为腐生菌，普遍存在于昆虫的消化道中，这类病原菌由于缺乏侵入昆虫肠壁的能力，很少造成昆虫的疾病。,细菌杀虫剂的种类,细菌杀虫剂Bacterial insecticide是利用对某些昆虫有致病或致死作用的杀虫细菌所含有的活性成分或菌体本身制成的，用于防治和杀死目标昆虫的生物杀虫制剂。,杀虫细菌主要来自芽孢杆菌科Bacteriaceae、假单孢菌科Pseudomonadaceae、肠杆菌科Enteaobacteriaceae、乳杆菌科Lactobacillaceae 和微球菌科Micrococcaceae等细菌类群。,目前的杀虫细菌约有100多种，但被研制出产品并投入使用的主要是其中的4种，即苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus) 、日本金龟子芽孢杆菌(Bacillus popilliae)和缓病芽孢杆菌(bacillus lentimorbus)。前两种属兼性杀虫芽孢杆菌，它们既能在人工培养基上生长，亦能在昆虫体内繁殖；后2者属专性杀虫芽孢杆菌，它们一般要在昆虫寄主体内才能生长并形成有侵染力的芽孢。另外，也有少数其它芽孢杆菌及个别芽孢的细菌开展成产品。,2 苏云金杆菌类杀虫剂,苏云金杆菌Bacillus thuringiensis是一种革兰氏阳性细菌，产生伴胞晶体，并能寄生于昆虫体内引起虫体发病的芽胞杆菌。,1901年日本石渡Ishiwate首次从病死的蚕体中别离出这类病原体，命名为猝到杆菌Bacillus sotto),1911年Berliner在?粮业杂志?上报道从德国苏云金的一个面粉厂1909年寄出的一批染病的地中海粉斑螟Anagasta kuehnilla) 幼虫体内别离到这种产伴孢晶体的芽孢杆菌。,1915年4月，他详细描述了该菌的形态和培养特征，并定名为苏云金杆菌Bacillus thurmgiensis Berliner)，简称Bt。,1938年，世界上第1个苏云金芽孢杆菌制剂Sporeine在法国问世，并用于防治地中海粉螟。从而掀开了苏云金芽孢杀虫剂生产的序幕。,1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，伴孢晶体主要由分子质量130 KD da的-内毒素蛋白组成。,McConnell等1959发现Bt的局部菌株在发酵过程中可产生一种热稳定的-外毒素苏云金素，并证明该物质具有一定的杀虫活性。,Heimpel于1967年将苏云金杆菌产生的几种毒素它们划分为四类，即外毒素、外毒素(苏云金素)、外毒素、内毒素(伴孢晶体蛋白消化激活后产生的毒性肽)。,Zakharyan,等,1976,年最先提出，质粒可能对伴孢晶体的编码起作用。接着，,Debabov,等和,Galushka,等,1977,年证实，苏云金杆菌含有质粒，它与伴抱晶体的形成有关。从而激起了苏云金杆菌遗传学研究的热潮。通过转化、转导、接合、融合等传递系统、使控制伴孢晶体形成的基因不仅在苏云金杆菌亚种之间，而且在不同种细菌之间，甚至与高等植物进行了转移或克隆，并获得了表达。,1981,年，,Schnept,和,Whiteley,首次将,HD-1,菌株伴孢晶体的基因克隆到大肠杆菌中，并得到表达。,1987,年，美国,Monsanto,公司用自己构建的,Sev,载体系统转移,Kurstaki,的内毒素基因，获得抗鳞翅目害虫的番茄转化株。,到目前为止，已别离出4万多个Bt菌种，报道了51个血清型根据菌体细胞鞭毛抗原的特异性结合生理生化特性的区别特征分出血清型 ，50多个亚种，已克隆出60多个毒素基因，我国目前已经报道有17个血清型26个亚种。,苏云金杆菌的生长,苏云金杆菌是好气性细菌，对温度发要求不严格，pH值最适宜。,其生活周期分为3个发育阶段,芽孢休眠期：芽孢又称孢子，是休眠阶段，在枯燥、高温或低温冷冻的条件下，能保存相当长的时间，它是保持种存活的形式。,营养体时期：芽孢在适宜条件下，24小时萌发成营养体，46小时横裂增殖，610小时分裂增殖最旺盛。菌细胞以对数速度增长。810小时之后，营养体进入原生质凝集阶段，细胞分裂减慢，芽孢开始形成。,孢子囊时期：在这一个时期，包括许多细胞学和生物化学的变化，结果在菌体细胞内形成卵圆形的芽孢。在芽孢的另一端那么产生蛋白质伴胞晶体。,苏云金杆菌产生的毒素,内毒素,细胞体内含有的；,外毒素,菌细胞在其生长过程中分泌于细胞外的代谢产物,外毒素 卵磷酯或磷酸酯酶C，是一种对昆虫肠道有破坏作用的酶；,外毒素 热稳定外毒素、耐热外毒素。由于这种毒素对家蝇有特异的致病作用，故也称蝇毒素。其产生与菌体的生长一致，在细菌生长过程中不断累积到培养基中。当细菌生长达最大时，毒素的产生也达最大量。芽孢开始形成时，毒素的产生也就完成。这一外毒素又叫苏云金素，有A、B两种。具有广谱的杀虫活性。对鳞翅目、双翅目、直翅目、鞘翅目的30多种昆虫有不同程度的毒杀作用，对桔全爪螨等一些螨类也有效；,外毒素 是一种或几种未经鉴定的酶，能使卵黄琼酯澄清。其毒力尚未证明。,内毒素 即伴胞晶体，又称晶体毒素，是一种蛋白质毒素，是苏云金菌的各类毒素中，研究得最多，又最为详尽的毒素。与芽孢形成同时生成，对热有一定的稳定性。65可保持1小时，80处理20min也不致破坏；,晶体的形态多种，菱形较为常见。,近年来人们又进一步从该菌发酵上清液中别离出Vips和具协同毒性作用的Zwittermicin A等活性成分。,在这些杀虫活性成分中，-内毒素亦称 为“杀虫晶体蛋白，Insecticidal crystal protein,ICPs是最主要的,内毒素的致毒机理,内毒素作为伴胞晶体亚单位存在时是无毒的。经溶解或蛋白水解酶水解后才变成有毒的多肽。伴胞晶体被敏感昆虫食入后，在中肠被强碱性的肠液PH8.9以上溶解，释放出一个或多个分子量为27000-140000Da的晶体蛋白，即为-内毒素。, -内毒素并被肠道蛋白酶水解释放出分子量更小的毒性多肽 。这些毒素被激活后，首先攻击的是中肠上皮细胞，并使中肠发生麻痹。影响中肠上皮的葡萄糖和离子吸收，可以作为神经毒素起作用，干扰寄主中肠细胞膜的运载过程，是中肠上皮细胞自溶的起动剂。另外，作为解偶联剂，破坏了中肠上皮细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化的正常功能。,值得注意的是，伴胞晶体和芽孢对哺乳动物是没有毒性和致病性的。主要原因是哺乳动物的消化道缺乏溶解晶体的适宜条件强碱性PH。另外昆虫肠液中的主要蛋白酶胰蛋白酶与哺乳动物的蛋白酶胃蛋白酶相比较，有一定差异。对于蛋白质的水解作用不同。胃蛋白酶对于变性晶体的作用是将之降解为无毒多肽。, 鳞翅目敏感昆虫中毒后的开展过程,第一阶段：030min。外形及运动正常，停止取食，血淋巴PH和K+轻度上升，中肠上皮不出现明显的组织病理变化；,第二阶段：30120分钟。轻度迟钝，幼虫运动缓慢，足部偶尔发生痉挛，心跳渐渐变慢，中肠停止蠕动，但是麻痹仅局限于中肠。此阶段末，幼虫呕吐和腹泻；,第三阶段：23小时。极度迟钝，幼虫受到机械刺激时，不能自由运动。中肠上皮前段发生病变的部位达整个中肠的20%30%；第四阶段：晶体进入34小时。全身麻痹，幼虫无反射活动，心跳完全停止。这一阶段之后1224小时，虫体皮肤出现许多斑点。解剖中肠也有许多黑色斑点，但没有出现穿孔。最后幼虫死亡。临死时虫体伸展，不久发黑，并呈腐烂状。,4 苏云金杆菌在害虫防治中的应用,在全世界范围内大约有800多种害虫有效。其中仅鳞翅目昆虫就有570多种。在我国可对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目等5个目33个科共125个种以上的昆虫有毒杀效果。,蔬菜害虫：菜粉蝶、小菜蛾,粮食作物：稻纵卷叶螟、玉米螟、三化螟,经济作物：棉铃虫、棉卷叶野螟、烟青虫、油桐尺蠖等,果林及果树害虫：枣尺蠖、苹掌舟蛾等,森林害虫：松毛虫、天幕毛虫、柳毒蛾等,卫生害虫：杀灭蚊幼虫,内毒素基因的克隆与表达,内毒素蛋白基因的定位,内毒素蛋白基因(结构基因和调节基因)是定位于染色体以外的复制子质粒上的。,目前已经发现苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白Insecticidal crystal proteins 简称ICPs的基因已有100多个，依据杀虫特异性和序列同源性的差异将ICP划分为cry1- cry28和cyt1-2两大类型。现在研究的重点是控制杀虫晶体蛋白的毒素基因 cry基因。,内毒素蛋白基因的分类,苏云金杆菌晶体毒素基因分为两个类型:一类是编码杀虫的晶体毒素蛋白的基因,称为晶体毒素基因(cry基因);另一类基因编码的,内毒素蛋白对各种脊椎动物和无脊椎动物离体细胞有溶解活性,称为细胞溶解毒素基因(cryA基因),为以色列亚种(H14)所特有,不同基因型杀虫谱不同，毒蛋白的大小及形状也不一样。根据杀虫谱的不同，将杀虫基因分成四大类，统称为,cry,基因，用罗马数字,、,、,、,等来命名，分别代表几类杀虫范围。在每一类型下根据氨基酸序列的同源性，又分为,A,B,C,等不同的基因型。在同一基因型下根据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为,a,b,c,等不同的基因亚型。其分类如下：,苏云金杆菌,内毒素蛋白基因的分类,基因类型,基因编码毒素蛋白的,基因的其他名称,杀虫谱,氨基酸数目,推算的分子量（,10,3,Da,CryIA（,a,）,L,1176,133.2,4.5-kb基因,cry1-1,CryIA(b),L,1155,131.0,5.3-kb基因,Kurhd1,btz,cry1-2,CryIA(c),L,1178,133.3,6.6-kb基因,cryIB,L,1207,138.0,CryA4,typeB,cryIC,L,1189,134.8,TypeC,BTV1,Bta,cryID,L,1165,132.5,cry,A,L/D,633,70.9,P2基因,cryB1,cry,B,L,633,70.8,CryB2,cry,A,C,644,73.1,CryC,cry,A,D,1180,134.4,130KDa内毒素基因,125KDa,蛋白基因,ISRH3,cry,B,D,1136,127.8,130KDa内毒素基因, ISRH4,Bt8,135KDa蛋白基因,cry,C,D,675,77.8,ORF1,cry,D,D,643,72.4,CryDa,cytA,D/cytol.,248,27.4,27KDa毒素基因,cryI基因：编码分子量130000-140000 Da的晶体蛋白cryI蛋白在芽孢形成过程中累积在棱形的伴胞晶体中，蛋白的毒性局部位于端段cryI基因又可分为cryIA(a、b、c)、cryIB、cryIC和cryID六种基因，对于所有cryI基因来说，基因的5端编码毒性蛋白，而3端对于编码蛋白的毒性不是绝对需要的。,cryII基因：编码65000Kd的毒素蛋白又称P2蛋白，这类蛋白形成立方形的伴胞晶体。,cryII基因与其它cry基因的同源性很有限。,cryIII基因：为对鞘翅目幼虫有毒性的拟步甲亚种和苏云金杆菌ZG2158菌株所特有，它们都为血清型H8a8b。,cry,基因编码对双翅目昆虫有特异毒性的椭圆形伴孢晶体。,cryA, 135 KD; cryB,128 KD; cryC,78 KD; cryD, 72 KD, cryA和 cryB基因在结构上与cry相似，毒性核心区段为53,78KD,位于原毒素蛋白的,N,端,.,-内毒素蛋白基因的克隆与表达,1981年，Schnepf和 Whiteley首先对斯库塔克亚种的HD-1菌株晶体毒素蛋白基因进行克隆；主要是在大肠杆菌HB101中得到表达；,1987年Whiteley等对8个亚种的晶体毒素蛋白基因在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中得到表达；,Sekar和Carlton1985)将以色列亚种的伴孢晶体基因转入到巨大芽孢杆菌，得到产不规那么行晶体的菌株VB131，该菌株形成芽孢的培养物能100%杀死蚊幼虫。可能在基因克隆与表达过程中会表现出毒性增加的现象。,5 -内毒素蛋白基因的遗传操纵,1986年，Shivakumar等将库斯塔克亚种的晶体毒素蛋白克隆到枯草芽孢杆菌中，克隆的片段上有晶体毒素蛋白基因的启动子，转录时，晶体毒素基因是用自身的 启动子，在菌体形成芽孢前的营养体时期表达了晶体蛋白。这说明，晶体毒素蛋白基因的表达可从芽孢形成的控制中解脱出来。,1987年，王宪和范云六通过库斯塔克亚种HD-1菌与以色列亚种的原生质体的融合，得到了既杀鳞翅目又杀双翅目幼虫的稳定融合子。这说明可以对其毒素蛋白基因进行遗传操纵。,Obukowics,等学者在,1986,年将,cry,A(b),基因经转座子,Tn5,介导引入到植物的假单孢杆菌中，使植物具有抗虫性，从而创造了第一代,Bt,转基因抗虫植物。这也是,Bt,毒蛋白基因使植物获得抗虫性的最早报道。真正的,Bt,毒蛋白转基因植物是第二代,Bt,抗虫,植物。,第一个成功的例子是由比利时的植物遗传系统公司在1987年6月报道的，他们用农杆菌介导法成功地将完整地cry(b)基因和3，5端缺失后只保存5端编码毒蛋白核心区的不同长度的cry(b)基因导入烟草获得了抗烟草天蛾的转基因烟草植株。自那时起，人们在Bt杀虫晶体蛋白基因的修饰和改造，表达裁体的构建，植物遗传转化方法及抗虫转基因植物的培育等方面有了大量的研究,Perlak等(1991)比较野生Bt毒蛋白基因和高等植物结构基因的DHA序列发现其含较多的AT碱基和ATTTA重复序列，便采用Kunkle的DNA点突变法，对野生型Bt毒蛋白基因CRYAD的AT富含区进行点突变，改变了63个Nt，使CC的含量从37增加到41，ATTA重复序列从13个减少到7个，改变编码95，故使转Bt基因植物中-内毒素提高10倍,又通过不改变原,Aa,编码的前提下改变,DNA,，使,390,个碱基对,60,密码子改变，使,GC,含量增加到,49,，但不含,ATTA,序列。这样全修饰后的,Bt,毒蛋白基因导入植物后，使植株体内的各毒素含量提高,100,倍，并表现出较强的杀虫效果，,199I,年用这种修饰过的,Bt,毒蛋白基因导入棉花而育成的转基系在,11,个点次的田间接种试验中杀虫效果强。其棉铃虫和烟青虫的为害率不到,1,，红铃虫在百铃中的活幼虫数仅,0.3,头，而对照的棉铃虫和烟青虫为害率几乎为,100,，红铃虫在百铃虫中的活幼虫数为,25,一,50,头。,1993,年,Fujimsto,等对,cryA(b),进行了广泛的修饰，在水稻中得到高效表达。,Adang,等用经过修饰的,cryA,转化马铃薯，,Koziel,等用经过修饰的,Cry1A(b),转化玉米，都得到高表抗虫效果的转基因植物。到目前为止国内外已有许多实验室和科研单位用不同的,Bt,毒基因和转化方法获得,50,多种不同的抗虫植物。有的已进入大田试验和商品化生产阶段。,到1997年，全世界已发放Bt转基因玉米品种11个，棉花和马铃薯品种各5个，主要种植于8个国家和地区，其中美国的种植面积最大。我国也从1991年起开始了Bt cryA杀虫基因的局部改造和全合成，并导入棉花、烟草、甘蓝等25种以上植物获得成功。目前全世界已获得50多种不同的抗虫转基因植物，技术趋向成熟，成果向商品化、实用化阶段深入，并开展大规模的田间推广试验。从1995年起，cryA类转基因玉米、棉花和马铃薯已商品化，性状有单剂引的抗玉米螟、抗棉铃虫和抗马铃薯甲虫，还有玉米和棉花的多基因抗虫+抗除草剂性状。,我国,Bt,转基因植物中，转,Bt,基因的抗虫棉花得到了商品化生产；其中浙江大学原子核农业研究所诱变育种中心通过与加拿大渥太华大学合作，在国际上率先利用农杆菌介导法于,1994,年成功的地获得了转,cryA(b)Bt,基因的水稻，并于,1998,年,6,月通过农业部批准进行环境释放试验。,1998,年,9,月通过鉴定，成为国际上最有希望最早实现商品的水稻品种。,2002年荷兰国际植物研究中心与保加利亚plovdiv大学联合将cry,Ba和cry la,组合起来，形成一种混合毒素，并在马铃薯上得以表达，可以对马铃薯甲虫和欧洲玉米螟进行控制。,3 其它细菌杀虫剂,3、1球形芽孢杆菌,迄今已别离到各种球形芽孢杆菌的菌株近700株，但有毒菌株较少，它们分属于总共48个血清型中的10个血清型。球形芽孢杆菌有毒菌株对库蚊、按蚊有较高毒力，对伊蚊幼虫的毒力那么不及苏云金芽孢杆菌以色列亚种的菌株，对蚋那么无毒力。但由于球形芽孢杆菌的芽孢和晶体在环境中持效期较长，并有可能在环境中再循环，因此对球形芽孢杆菌高毒菌株的筛选及制剂研究从80年代中后期开始受到重视。我国生产了Bs-10,C3-41等乳剂，曾在野外大面积用于蚊幼虫的防治。,球型芽孢杆菌对蚊幼虫的致病性或致死作用是通过毒素或与孢子囊体有关的毒素或芽孢实现的。,在产生伴孢体的菌株中，伴孢体具有最大的杀虫活性。,BS毒素与BT的内毒素的作用方式有相似之处，即都需要酶的激活才能对细胞有毒性，但BS毒素的受体是糖蛋白，而BT内毒素的受体是磷脂,球型芽孢杆菌高度的致病力、较长的持效期和在污水期中仍有较强的杀虫活性，被世界卫生组织列为最有希望的生物杀虫剂之一。,3.2,日本金龟子芽孢杆菌和缓病芽孢杆菌,日本金龟子芽孢杆菌以及缓病芽孢杆菌能使蛴螬产生,A,型乳状病和,B,型乳状病。第一个日本金龟子芽孢杆菌制剂,Doom,于,1950,年在美国登记，成为该国政府批准登记的第一个生物防治制剂。由于日本金龟子芽孢杆菌和缓病芽孢杆菌尚不能在人工培养基上生长形成有侵染力的芽孢，因此商品制剂,Doom,Japidemic,Grub,，,Attack,及,Milky-spore,等都是采用幼虫活体培养的方式来生成的。迄今这,2,种菌尚未能在人工培养基上发酵生产，已成为大规模生产的主要障碍。,近年来国外试图克隆金龟子芽孢杆菌和缓病芽孢杆菌的杀虫活性蛋白的编码基因并导入其它受体菌中进行表达，这为进一步开发利用此菌提供了新的途径。,4,、细菌杀虫剂存在的问题及展望,伴随抗虫基因工程进展，其在应用方面潜在的问题也日益显露，主要表现在以下几个方面：,首先，Bt杀虫晶体蛋白的抗虫谱较窄，而限制了其抗虫基因工程中的应用，虽然已别离到众多的Bt毒蛋白基因，其抗虫谱几乎覆盖了所有的鳞翅目害虫，但具体而言，每一种Bt毒蛋白基因的抗虫谱却十分有限，或只对某个种或某些种有抗性。针对这个问题，在Bt毒蛋白基因工程研究中已提出了两种解决方法。,其次，由于转基因植物给昆虫提供了个连续恒定的选择压，使昆虫在群体水平上产生了耐药性。Van montage博士指出：“转Bt毒蛋白基因植物如欲取得实用价值，那么必须解决害虫易对其产生耐药性的问题。为此，目前已有多种策略甚至几种方法综合运用来防止昆虫抗性的产生。,第三是Bt毒蛋白基因在植物体内的沉默与甲基化、转基因的拷贝数、插入受体植物果包体位点及转基因是否与受体植物中有同源基因等有关。使其表达水平低。目前人们已设计了几种对策。,第四，Allison等认为Bt毒蛋白可能成为转Bt毒蛋白基因植物最严重的生态危机。有关转Bt杀虫晶体蛋白基因植物潜在的生态危险；已引起生态学家生物学家和农学家们的密切关注，这方面的研究已成为热点，有关转基因植物对生态环境和食物平安性的影响已进行了不少研究，积累了一大批有价值的资料。但目前已商品化的转Bt杀虫晶体蛋白基因植物对生态环境产生危险性的报道末见报道。,第五不少文献报道了转基因植物会产生一系列性状变异。吴刚等研究发现，转cryA(b)，cryA(c)Bt毒蛋白基因的水稻株系在株高、穗长、单粒重、面粒重和结实率等方面都显著降低，而单株有效分数增多，生育进程推迟，落粒性增强。所以选择优质表型且具较强杀虫的转基因植物，对于创造优良性状的抗虫植物至关重要。,细菌杀虫剂的应用有两条途径，一条是直接应用，另一条是通过基因工程技术得以实现其增加效果的可能性。,转基因植物工程是一项应用性极强的研究，它使短时间内培育出抗虫植物品种成为可能，同时正在进行田间试验的性状中，多基因抗虫性状也屡次出现。将Bt基因，特殊的抗病基因等优良品质基因集聚于同一品种。相信不久的将来，人们会实现培育抗虫作物，减少环境污染，保护人类健康的美好愿望。但有关的平安性问题一刻也不能无视。,