HPLC分析方法的建立与开发

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,建立分析方法,色谱分离度与分离性能,HPLC,分离的机理,色谱工作者关心的基本问题,-,色谱峰之间的分离度,t,o,t,RA,mAU,time,t,RB,R =,分离度,t,RA,=,组分,A,的保留时间,t,RB,=,组分,B,的保留时间,w =,峰的基线宽度,w,1/2,=,半峰宽,分离度值,等梯度洗脱的基本分离度公式,N,:,总的理论塔板数,;,柱效,k:,容量因子,(,保留因子,),色谱峰的保留作用,：,色谱峰的相对分离程度,;,选择性作用,影响分离度的因素,容量因子对分离度的影响,容量因子,-,流动相组成的影响,选择性,影响选择性的参数,降低,增加,较弱的溶剂,较强的溶剂,异丙醇,/,水,甲醇,/,水,乙腈,/,水,C-2,C-18,容易超载,不容易超载,改变流动相组成,改变固定相,有机成分含量低的固定相 有机成分含量高的固定相,色谱柱温度对分离度的影响,柱效,计算柱效,典型的流速值,4.6,1-2,3.0,0.4-0.8,2.1,0.2-0.4,1.0,0.05-0.09,柱内径,mm(5um,粒度,),mL/min,flow rate,2,=,i.d.,2,i.d.,1,2,flow rate,1,柱外体积的影响,10 L,20 L,Time, min.,2.1 x 150 mm,F = 0.2 mL / min.,样品体积,连接管路的体积,检测器体积,检测器电子线路的时间常数,所需分离度与柱长匹配,峰对称性,提高分离度,增大,k,增加选择性,提高柱效,分离度与,k, n,和, 的关系,液相色谱流动相及固定相,流动相,与,GC,流动相不同，,HPLC,流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一起参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。,1,、,理想的溶剂应有下列特性,1,）化学稳定性好，,与固定相不互溶、不发生反应,2,）,必须和检测器相适应,使用,UV,检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长,使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别,3,）对待测物具一定极性和选择性,4,）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；,尽量避免使用有显著毒性的溶剂,5,）适宜的粘度,粘度过高，柱压增加,过低（例：,戊烷、乙醚等）,，易产生气泡,2,、溶剂的极性,溶剂的极性强弱用溶剂强度参数表示，强度参数值越大，表示溶剂的洗脱能力越大。,序号,溶剂,紫外波长极限（,nm,）,序号,溶剂,紫外波长极限（,nm,）,1,异辛烷,197,9,氯仿,245,2,正己烷,190,10,二氧六环,215,3,甲基叔丁基醚,210,11,丙酮,330,4,苯,278,12,乙醇,210,5,二氯甲烷,233,13,醋酸,6,正丙醇,240,14,乙腈,190,7,四氢呋喃,212,15,甲醇,205,8,乙酸乙酯,256,16,水,200,3,、流动相的选择,4,、梯度洗脱,特点：可以缩短总的色谱周期，提高分离效能，改善峰形，减少拖尾，可以增加灵敏度，会引起基线漂移,固定相,化学键合固定相,方法,：通过化学反应将有机分子键合在载体表面形成柱填,（,约有,3/4,以上分离问题是在化学键合固定相上进行,）,特点：,稳定、流失小、适于梯度淋洗,分离机理：,兼有吸附、分配两种分离模式。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。,载体,主要是硅胶（表面有硅醇基）,特点为：, 可以制备成粒度分布窄的多种粒度, 机械强度好，可以填充成稳定、高效的填充床, 长期高压操作下不变形, 反压较低、柱寿命长, 较其它材料制成的柱有更高的柱效, 适用于小分子、大分子的分析和制备, 高,pH,值下会分解（,pH,8,）,键合方法：,（,l,）硅酯化（,Si-O-R,）,键合固定相,（,2),硅氮型（,=,Si-N=,）,共价键合固定相,（,3,）硅烷化,（,Si-O-Si-R,）,键合固定相,使用键合固定相应注意的问题,硅胶键合相的稳定性,键合相色谱分离的重现性,键合相色谱分离的选择性,键合相色谱柱的再生,化学键合相色谱法,正相色谱和反相色谱,反相色谱的定义：,在非极性的固定相上，用极性较大的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：反相色谱中键合固定相的极性要小于流动相的极性,正相色谱的定义：,在极性的固定相上，用极性较小的液体作流动相进行物质分离分析的方法。即：正相色谱中键合固定相的极性要大于流动相的极性,正相色谱和反相色谱,正相色谱和反相色谱的差别：,正相色谱,反相色谱,固定相极性,大,小,流动相极性,小至中等,中至大,组分流出顺序,极性小的组分先流出,极性大的组分先流出,流动相极性增大,保留时间变小,保留时间变大,分离组分,油溶性或水溶性的极性和强极性化合物,非极性、极性或离子型化合物,正相色谱,低极性流动相,反相色谱,高极性流动相,中等极性流动相,中等极性流动相,时间,时间,时间,时间,待测物极性：,ABC,正、反相色谱中极性和保留时间的关系,正相键合相色谱法,固定相：,正相色谱中采用,极性,键合固定相，是把全多孔（或薄壳）微粒硅胶载体，经酸活化处理制成表面含有大量,硅羟基,的载体后，再和含有胺基、腈基、醚基的硅烷化试剂反应，生成表面具有,胺基、腈基、醚基,的极性固定相。,流动相,：,在非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），分离极性化合物。此时，组分的分配比,k,值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。,主要用于分离,异构体,、,极性不同,的化合物，特别适用于分离,不同类型的化合物,。,反相键合相色谱法,采用,非极性键,合固定相,是把全多孔,(,或薄壳,),微粒硅胶载体,经酸活化处理后,和含有,烷基链或苯基,的硅烷化试剂反应,生成表面具有烷基,(,或苯基,),的非极性固定相，如,C18,、,C8,流动相：,流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙腈、水和无机盐的缓冲溶液等。它多用于分离多环芳烃等低极性化合物,若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相，可用于分离极性化合物,若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有机酸、有机碱、酚类等,具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点,硅胶,-,烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响,时间，,min,固定相：,C,1,固定相：,C,8,固定相：,C,18,1-,尿嘧啶；,2-,苯酚；,3-,乙酰苯；,4-,硝基苯；,5-,苯甲酸甲酯；,6-,甲苯,可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。,分析方法建立,分析时要了解的情况,想办法得到各种信息,向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法,查文献和方法，如,CA,AA,AOAC,EPA-,仪器制造商的文献,充分了解自己的样品,对色谱柱有足够的了解,掌握分离机理，自己开发方法,分析时要了解的情况（续,1,）,灵敏度的要求有多高,?,样品的本底是否很复杂,?,有多少组份要分析,?,对分析的精确度、准确度等有多高要求,?,是否因是日常检验，而要求方法容易使用,?,分离,(,制备,),时要了解的情况,要分离（即制备）的样品量有多大,?,要分离的组份在样品中的含量很高,?,还是微量,?,是否需要保持生物活性,?,对分离产物纯度的要求有多高,?,纯度或活性的鉴定如何完成,?,什么化合物参数能用于分离,?,分子量不同,/,MW 2000,凝胶渗透,/,凝胶过滤,离子化分子,离子对,/,离子交换,极性不同,吸附,/,反相色谱,同系物,/,苯系物,反相,中性、酸和碱的混合物反相,生物分子,亲和,/,HIC/,凝胶过滤,/,反相,立体异构体,吸附,手性化合物,手性色谱,结构数据,数据收集,?,固定相和流动相选择,一般的具体步骤,先用一根短的色谱柱,用相对较高的流速,使用尽可能纯度高的标准品,先用高强度的洗脱液,调节,k,值改变保留值,调节,值改变选择性,调节柱长度改变柱效及分离速度,记住,每次改变一个参数,使用文献方法注意点,色谱柱填料的种类、品牌是否相同,?,注意文献方法的流动相,是否损害色谱柱,?,如色谱填料品牌不同，需要调整流动相,注意色谱柱的规格：内径、柱长,需要调整流速、进样量,注意梯度条件,了解系统的滞后体积（梯度）,色谱方法转换,如果没有与文献或要求相近的色谱柱,转换进样量,转换流速,常规样品分离的系统方法,总的指导原则,改变可以明显改善选择性的条件,避免会影响方法普适性的实际问题,减少必要的实验次数，尽可能地利用计算机模拟,选择适用于各种常规试样的实验，以便采用同样的方法建立未知样品（离子的或中性）的,HPLC,分析方法,先做简单易行的 实验（改变色谱柱、改变,pH,、使用复杂的混合溶剂等属于比较难做的条件）,反相,HPLC,分离的总体方案设计,1,、确定样品是属于常规的还是特殊的,特殊样品包括：,无机离子,对映体,生物分子,合成的高分子,碳水化合物,异构体,2,、选择分离条件，进行第一次分离,分离变量,最佳的初始选择,柱填料,C,8,或,C,18,柱结构,15cm*4.6 mm,或,25cm*4.6 mm,，,5,m,流速,1.0 ml/min,（或,2.0 ml/min,）,流动相,乙腈,水（中性样品）,乙腈,-,缓冲液（离子型样品）（缓冲液为,25-50mM,磷酸缓冲液，,pH 2,3,）,对初始试验：,5 100%B,梯度,温度,常温,进样量,50,L,（,20 L,）,选择流动相,在反相色谱中常用水,/,乙腈,pH,的选择思路, 选低,pH,可以使柱硅羟基质子化并降低其色谱活性, 低,pH,与常见酸碱官能团的,pKa,值相差较远，组分在此条件下的,t,R,受,pH,变化影响小,初期应,避免使用,三乙胺和离子对试剂等添加剂,准备标准样品,过滤样品,安装色谱柱,冲洗柱，平衡,平衡检测器,进样,分析结果,!,第一次,HPLC,运行,!,第一次,HPLC,运行,选择逐步方法开发步骤,用强洗脱液开始等梯度洗脱，此后每次运行降低洗脱液强度,尝试运行梯度,!,第一次,HPLC,运行,无峰,/,响应,分离度差的峰,第一次运行得到的结果可能,:,检测方法不正确,浓度太稀,提高进样浓度，或者在无色,谱柱的条件下注射少量样品,改变流动相,优化系统,得到了色谱峰,-,是,-,否,检查,HPLC,系统,3,、做初次运行并根据谱图将样品分类,0.5k20,等度洗脱可行，超出此范围,等度洗脱可行的样品,建议用梯度洗脱的样品,反相保留太弱的样品,改变,pH,、加入离子对试剂、改变柱子、改用正相色谱,强保留样品,用非水反相或正相条件,复杂样品,4,、对等度方法，用初始梯度运行来估计第二次等度运行的最佳,B%,5,、评价第二次运行中峰的质量,-,柱效、峰宽、峰形,峰太宽或不对称：要改变初始的分离条件（柱子、,pH,、添加剂等）,运行情况良好：平行实验，保证柱平衡和可重复的保留时间,6,、 对等度方法，可以改变,ACN%,来改善峰间距和分离度,若有必要，,ACN,改为,MeOH,，并根据峰间距和分离度优化,MeOH%,可以进一步混合,ACN,和,MeOH,成为三元溶剂系统，并优化,7,、若,6,方法中分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件,8,、对梯度方法，用改变梯度变化速度和柱温来优化峰间距和分离度,结果满意，可以按等度分离方法优化溶剂类型,分离不充分，则可以改变分离的选择性和分离的附加条件,9,、对梯度方法，改变初始和最后的,B%,、梯度变化速度、梯度形状可以改善分离度或缩短运行时间,10,、对等度或梯度方法，改变一个柱条件（柱长、流速、填料尺寸）可以提高分离度或降低运行时间,等度分离方法,反相色谱的方法开发,开发过程实例,色谱条件,色谱柱：,C,18,，,4.6mm,15cm,流动相：乙腈,/,水，不同的溶剂强度，,60/40,、,50/50,、,40/60,，由强渐弱 （或走梯度）,流速：,1ml/min,样品：, 对羟基苯甲酸甲酯,(Methyl Paraben),对羟基苯甲酸丙酯,(Propyl Paraben),对羟基苯甲酸丁酯,(Butyl Paraben,),改变容量因子,K,(,改变比例,),对羟基苯甲酸甲酯, 对羟基苯甲酸丙酯, 对羟基苯甲酸丁酯,通过改变,流动相比例,改变选择性,改变选择性,通过改变,流动相组成,改变选择性,同样强度的不同溶剂,固定相优化：改变色谱柱,0,2,4,6,8,10,12,0,2,4,6,8,10,12,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,1,2,4,5,6,7,8,9,10,3,C-18,C-8,Optimization,10,种巴比妥药物的分离（等梯度）,保留时间,(min),3.14,相对吸光度,4.55,5.74,6.44,7.11,7.74,10.76,11.79,12.63,1,巴比妥,2,阿洛巴比妥,3,阿普比妥,4,苯巴比妥,5,异丁比妥,6,环戊巴比妥,7,布他比妥,8,海索比妥,9,异戊巴比妥,10,甲苯比妥,25%,乙腈,1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,3,13,优化流动相,-,困难的分离,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,0,20,40,60,80,100,0,20,10,40,30,50,60,70,80,90,100,乙腈,/,水,甲醇,/,水,四氢呋喃,/,水,甲醇,1,4,6,7,2,5,3,四氢,呋喃,乙腈,1.,从甲醇,/,水开始，优化溶剂组成以使所有色谱峰在合理的,k,范围流出,.,2.,选择洗脱强度相等的乙腈,/,水混合流动相进行下一次分析,.,3.,用四氢呋喃,/,水流动相重复分析,4.,按比例混合等强度流动相再进行进样分析,优化,三种流动相的比较,25%,乙腈,35%,甲醇,21%,异丙醇,洗脱顺序,选择性,离子型化合物的分离方式,使用离子交换柱离子交换法,主要用于,“,强,”,阴、阳离子,使用反相柱,通过改变流动相的,pH,值，使样品成中性,加入,“,对离子,”,，使样品呈中性,离子型化合物在反相色谱柱上不保留,改变流动相的,pH,值，抑制样品离子的电离,适用于弱酸性化合物的分离,降低流动相的,pH,值，使样品降低离子化,使用硅胶基质,C,18,填料,使用条件应在填料基质的范围内,硅胶柱的,pH,在,2-8,内,如果：,一些酸在,pH,低于,2,时还保持离子化,一些碱在,pH,高于,7,时还保持离子化,可以有以下的选择,离子交换色谱,使用聚合物反相柱，在,pH,高于,7,时用离子抑制法,使用,“,离子对色谱法,”,分离弱离子化化合物的初始实验条件,水相缓冲液,/,乙腈,可变,(k = 0.5,20),分离变量,初始选择,尺寸,粒度,键合相,15 (,或,25) x 0.46 cm,5,或,3.5,m,C,18,或,C,8,溶剂,A,和,B,（,% B,）,温度,体积,质量,40,C,20,L,1.5,的条件下，柱效的变化对采用峰面积定量的定量分析结果没有影响，而对使用峰高定量的定量分析结果有影响,。,如其他因素不变，如：,K,，,a,，,流速等，柱效增加峰面积基本不变，而峰高增加,液相色谱流动相的组成变化，如采用梯度洗脱时，固定相、洗脱液和待测组分之间的平衡很难保持一致，洗脱时基线也常出现漂移使峰面积、峰高测量产生误差。,4,、检测器特性,检测器工作的稳定性和线性范围直接影响色谱定量分析结果的准确性和重复性。,5,、分离度,分离度的大小直接影响峰面积和峰高的计算准确度，进而影响色谱定量分析的准确度,。,（四）定量分析的误差来源和校正方法,色谱定量分析中的每一步操作过程都会带入误差，最后定量分析结果的误差则是前面每一步误差的总合。,1,、系统误差,（,1,）样品制备过程中待测组分的损失,溶解是否完全、浓缩和预分离时是否有挥发、萃取和沉淀是否完全等,（,2,）色谱仪进样分流比、衰减比不正确或线性响应范围窄,进样分流比不正确造成进样量误差；,衰减比（记录仪）不正确造成峰面积测量误差；,线性范围过窄，引起进样量不当，,响应值超过线性范围，出现计算误差,（,3,）由不正确的标准校正曲线和校正因子引起,曲线,A,：因在零浓度时仍有色谱峰，可能有杂质未分开,曲线,B,：在此浓度内，检测器的响应值是非线性的,曲线,C,：可接受的理想状态,曲线,D,：表明有样品的损失，可能是色谱柱的非特征吸附，也 可能是样品制备时的损失,（,4,）测量者不良习惯和偏向引起,由,(1),、,(2),、,(4),产生的系统误差在色谱定量分析中可采用内标法或标准加入法加以校正，由（,3,）产生的系统误差只能使用已知准确含量的标准样品进行校正。,2,、随机误差,色谱定量分析中的随机误差是指那些原因无法查明、大小随机涨落而且不可避免的误差,3.,过失误差,主要是由操作者工作中的马虎和操作的错误引起的。如：称量错误；样品处理时带入的组分损失和污染；读数错误；仪器操作误差；计算错误等。,