遗传物质的分子结构性质和功能课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一章 核酸的分子结构、性质和功能,第一节,DNA,的结构与功能,第二节,RNA,的结构与功能,第三节 核酸的分子杂交,第四节 反义核酸及药物,第五节,RNA,干扰,1869,年，,F.Miescher,从脓细胞中提取到一种富含磷元素的酸性化合物。,称核素,(nuclein),一、核酸的种类和分布,核酸有两大类：,DNA,和,RNA,DNA,分布的主要场所：细胞核，线粒体，叶绿体,RNA,分布的主要场所：细胞核，细胞质,细胞生物中,DNA,和,RNA,均有,病毒体内则只含有,DNA,或,RNA,二、核酸是主要的遗传物质,历史经典实验证明遗传物质是,DNA,而不是蛋白质,1928,年,Griffith,肺炎球菌转化实验,1943,年,Avery,离体条件下完成转化,1952,年,Hershey Chase,噬菌体转导实验,一、,DNA,的一级结构,DNA,的一级结构,是由,4,种脱氧核糖核苷酸即：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶脱氧核苷酸，通过,3,，,5,，,磷酸二酯键连接起来的直线形或环形多聚体。,第一节,DNA,的结构与功能,DNA,的一级结构,5,3,5,5-3,DNA,的相对分子质量非常大，通常一个染色体就是一个,DNA,分子，最大的染色体,DNA,可超过,10,8,bp,。,bp, base pair,b,base,那么一种生物基因组有多大呢？,DNA,分子量的表示方法,C,值,：一个物种单倍体的染色体所含的,DNA,的量。,C,值矛盾,：,DNA,含量与其结构和功能并不一致，可能有的基因种类远大于实际所需的,DNA,含量。,为了阐明生物的遗传信息，首先要测定生物基因组的序列。迄今已经测定基因组序列的生物数以百计，其中包括病毒、大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和拟南芥菜、玉米、水稻和人类基因组。,Genome size,Gene number,基因组大小实际上就是它的,C,值,DNA,的二级结构就是指两条脱氧核苷酸链反向平行排列所形成的双螺旋结构,右手螺旋，,A-DNA,、,B-DNA,、,C-DNA,、,D-DNA,左手螺旋，,Z-DNA,双螺旋,碱基倾角,/o,碱基间距,/nm,大沟和小沟,每轮碱基数,螺旋方向,A-DNA,20,0.26,大沟窄，很深,小沟很宽，浅,11,右,B-DNA,6,0.34,大沟宽，深,小沟窄，很深,10,右,Z-DNA,7,0.37,大沟平坦,小沟很窄，深,12,左,不同螺旋形式,DNA,分子主要参数比较：,二、,DNA,的二级结构,关于,DNA,双螺旋的小沟和大沟,大沟 宽,小沟 窄,蛋白质的,alpha,螺旋,1.B-DNA,是活性最高的,DNA,构象，,B,变成,A,仍有活性，但变成,Z,，活性明显降低。,2.,双螺旋是动态的平衡，结构改变以适应行使不同的功能。,说明：,三、,DNA,的三级结构,DNA,三级结构,是指,DNA,分子通过扭曲和折叠所形成的特定构象。包括不同二级结构单元间的相互作用、单链与二级结构单元间的相互作用及,DNA,的拓扑特征。,超螺旋,是三级结构的一种形式。,拓扑结构 见,p9,就是指在,DNA,双螺旋的结构基础上，,DNA,进异步扭曲形成的特定的空间结构。超螺旋是其主要的形式。超螺旋又有正和负之分。,负超螺,DNA,易于解链。,DNA,的复制、重组和转录等过程都需将两条链解开，因此负超螺旋有利于这些功能的进行，但这些过程需要的需要的负超螺旋程度是各不相同的，可以通过,DNA,的拓扑结构来调节其功能,拓扑异构酶,DNA,的拓扑异构体之间的转变是通过拓扑异构酶,(topoisomerase),来实现的。,四、,Triplex,（三股螺旋）,Hoogsteen,于,1963,年描述了三股螺旋结构。,第三股碱基可与,Watson-Crick,碱基对中的嘌呤碱形成,Hoogsteen,配对；,第三股与寡嘌呤核苷酸之间同向平行；,第三股可来自分子间也可来自分子内。,RNA,的一级结构,RNA,的二级结构,分子内的局部双链 图,tRNA,RNA,的三级结构,tRNA,三叶草 倒,L,rRNA,的高级结构,其他,RNA,高级结构 核酶：锤头型、发夹型等,第二节,RNA,的结构与功能,一、,RNA,的结构,RNA,的一级结构,RNA,的二级结构,RNA,的二级结构,二、,RNA,的功能,mRNA,tRNA,rRNA,细菌,rRNA,有,5S,、,16S,、,23S,三种；,哺乳动物,rRNA,有,5S,、,5.8S,、,18S,、,28S,四种,sRNA,snRNA,核小,RNA,scRNA,胞浆,RNA,通常与蛋白质结合形成核糖核蛋白颗粒（,RNP,），,U-snRNP,对基因表达和细胞功能有调节功能的,RNA,miRNA,RNAi RNA,干扰,一、核酸的变性和复性,核酸的变性,（,denaturation,）是指核酸双螺旋氢键的断裂，变成单键并不涉及共价键的断裂。共价键的断裂是核酸的降解,.,将,DNA,双螺旋失去一半时的温度称为该,DNA,的,Tm,（,melting temperature,）,第三节 核酸的分子杂交,p15,复性（,renaturation,）变性,DNA,在适当的条件下又可使两条彼此分开的链自发重新缔合成为双螺旋结构的过程称为,复性,。变性,DNA,在缓慢冷却时可以复性，称为,退火,核酸的变性和复性在基因工程中有何应用？,已经复性的,DNA,分子如果两条链来源不同，就叫,杂交分子,核酸的杂交,（,hybridization,）,序列互补的单链,RNA,和,DNA,，或,DNA,和,DNA,，或,RNA,和,RNA,，根据碱基互补的原则，借助氢键相连而形成双链杂交分子的过程,二、核酸分子杂交的基本原理,探针,probe:,是一段可以与靶核酸序列特异结合发生相互作用的核酸序列，经过标记后可以用来检测出靶核酸序列,探针的性质：,DNA,，,RNA,，双链或单链均可,探针的长度：从,20bp,到几,kb,都可以,探针的标记：同位素或非同位素,三、核酸探针及标记,1.,Southern blot,1975,英国分子生物学家,E.M.Southern,发明的,DNA,印迹方法,检测,DNA,2.,Northern blot,1977,年,Alwine,建立,Thonas,改进 的,RNA,印迹方法,检测,RNA,3.,Western blot,以亲和或免疫反应检测蛋白的蛋白质印迹方法,四、核酸分子杂交的应用,Southern Blot,4.,hybridization in situ,原位杂交,在组织或细胞水平上使用标记探针与细胞内,DNA,或,RNA,杂交的方法,5.,其他形式的杂交,如斑点杂交,狭缝杂交,菌落杂交,噬菌斑杂交,本质还是,Southern or Northern blot,6.,Biochip,生物芯片,来源于微阵列技术,(Microarray),生物芯片,：将数以万计的生物大分子探针分别固定在微小载体表面而制成的芯片。目前有蛋白质芯片和核酸芯片两类。,原理,:,核酸或蛋白质之间的杂交,1998,年世界十大科技进展之一,第四节 反义核酸及药物,p18,（,1,）概念：,反义核酸,是根据碱基互补的原理,利用人工合成或细胞中天然存在的,DNA,或,RNA,片段,(,或其化学修饰的衍生物,),与目的靶序列核酸结合，通过空间位阻作用或诱导,RNAase,活性的降解作用，在复制、转录、剪接、,mRNA,转运及翻译等水平上，抑制或封闭目的靶基因的表达。,反义核酸的功能主要取决于其稳定性、生物利用度以及与靶基因结合或反应的特性。,1.,反义核酸,(antisense nucleic acid),（,2,）,.,反义核酸作用的靶区域,mRNA5,非翻译区,mRNA5,编码区,mRNA5,帽子形成位点区域,前体,mRNA,外显子与内含子结合部位,mRNA polyA,形成位点区域,阻止,mRNA,的成熟及其向胞浆中的转运,反义技术,是利用人工合成或细胞中天然存在的,DNA,或,RNA,片段,(,或其衍生物,),与特定的基因相互作用,从而抑制基因的表达。目前发展到第三代。,第一代 硫代修饰寡聚核苷酸,第二代 甲氧,/,乙氧基反义寡核苷酸,第三代 肽核酸（,PNA,）,2.,反义技术与药物,20,年来,反义核酸药物的发展非常缓慢,仅有一个反义药物进入市场,惟一获得批准的,RNA,反义药物是,1998,年,8,月,27,日得到美国,FDA,正式批准的诺华、,Isis,制药的福米韦生（,fomivirsen,、,Vitravene,），该药主要用来治疗艾滋病人的巨细胞病毒性视网膜炎。,其他大部分都在,期临床试验中遭遇失败,有关反义新药的申请也很快被,FDA,驳回。,人们开始把目光投向竞争,RNA,技术平台尤其是小干扰,RNA(siRNA),。,这是否意味着反义核酸药物没有发展前途了呢,?,第五节,RNA,干扰（,RNA interference,，,RNAi,）,2002年度,Science,评选的10大科学成就中,RNAi,名列榜首,1998,年诺贝尔奖,从反向的角度为基因表达调控的研究，基因的功能分析提供了更好、更有效的手段,概念一：正义链和反义链,RNA,组成的双链,RNA,可有效抑制靶基因的表达，这种现象称为,RNA,干扰。,概念二：,RNA,干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链,RNA,（,double-stranded RNA,，,dsRNA,）诱发的、同源,mRNA,高效特异性降解的现象。（来自于网络）,1.,概念,2. RNA,干扰作用原理,RNAi,抑制基因表达方式：,（,1,）与,mRNA,形成双链，阻止蛋白与靶,mRNA,的结合；,（,2,）促使目标,mRNA,的降解。,3,种不同的,survivin siRNA,对,EJ28,细胞增殖和凋亡的影响,第三军医大学学报,2007/22,目的,观察靶向,survivin,的不同,siRNA,对,EJ28,细胞增殖和凋亡的影响。,方法,通过化学合成方法合成,3,对,siRNA,和,1,对荧光标记的阴性对照,siRNA,。转染荧光标记的,siRNA,后,在荧光显微镜下观察转染效率。实验分为,siRNA164,、,siRNA167,、,siRNA389,、阴性对照组、脂质体对照组和细胞对照组。转染后,24h,、,48h,和,72h,MTT,法检测,siRNA,对,EJ28,细胞增殖的影响,流式细胞术检测凋亡率。,结果,靶向,survivin,的序列特异性,siRNA,均能抑制,EJ28,细胞的增殖,其中以,siRNA164,抑制细胞的增殖能力最强,(P0.05),转染,48h,后的抑制率最高,(41.322.54)%;,转染,48h,后,siRNA164,组凋亡率最高,(13.200.25)%,。,结论,靶向,survivin,的,RNAi,技术在膀胱癌的基因治疗中可能具有一定的价值,文献选读,3. microRNA,或,miRNA,，小,RNA,MicroRNAs (miRNAs),是一种大小约2123个碱基的单链小分子,RNA，,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链,RNA,前体经过,Dicer,酶加工后生成。,最早被发现的两个,miRNAslin-4 and let-7,被认为是通过不完全互补结合到目标靶,mRNA 3,非编码区,端，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成。,多个果蝇,miRNA,也被发现和他们的目标靶,mRNAs,的,3,非编码区有部分同源。由于,miRNA,和其潜在的目标靶之间并非完全互补，这使得通过信息学的方法鉴定,miRNA,的目标靶位点变得困难。,MiRNA,的作用目标靶和活性机制一直是各地的研究人员的关注热点。,MicroRNA-21 targets tumor suppressor genes in invasion and metastasis.,Cell Research,(2008) 18:350-359.,MicroRNAs (miRNAs) are a class of naturally occurring small non-coding RNAs that target protein-coding mRNAs by repressing translation or causing mRNA degradation. Mature miRNAs comprise about,22 nucleotides, derived from long transcripts pri-miRNAs and pre-miRNAs.,Although miRNAs operate in a similar fashion as short interfering RNAs (siRNAs),they typically target a cluster of genes instead of one specific gene,.,It is predicted that an average miRNA can have more than 100 targets.,Emerging evidence demonstrates an important role of miRNAs in,regulating diverse cellular processes including differentiation, proliferation and apoptosis,.,Deregulation of miRNAs affects normal cell growth and development, leading to a variety of disorders including human malignancies.,Of particular interest, the overall miRNA expression pro normal tissues is distinct from that of tumor tissues. Specific sets of miRNAs may serve as biomarkers to predict clinical outcomes.,miRNAs can function,as tumor suppressors or oncogenes,depending on whether they specifically target oncogenes or tumor suppressor genes. In this regard, tumor suppressive miRNAs are usually under expressed in tumors. For instance,let-7,mir-15,and,mir-16,are downregulated or deleted in lung cancer and leukemia. By contrast, oncogenic miRNAs, such as,mir-21,and,mir-155,are overexpressed in tumors or tumor cell lines.,关于,RNA,反义技术应用？,RNA,反义药物三朵金花：,反义,RNA,，,siRNA,和,miRNA,科学研究,临床应用,