蛋白质和多肽的氨基酸序列测定课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五课蛋白质和多肽的氨基酸序列测定,蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长,链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠、,卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的,一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。因此，测定蛋白质的氨基酸,序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。另外，蛋白质一级,结构的信息也有助于对其基因结构的研究。,目前，进行蛋白质序列测定有两个关键步骤，即：,氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多肽的末端切割下来；,正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基。,其中第一步可采用化学法或酶法进行裂解。由于化学法较之酶法具有,裂解率高、易于自动化、耗费少等诸多优点，被蛋白质化学实验室普遍,采用，可以从蛋白质和多肽的N端进行裂解，也可以从C端进行分析。,第二步通常是在氨基酸残基上衍生了一个生色基团，通过高效液相色,谱进行分离分析。 本章将就蛋白质和多肽的N端、C端氨基酸序列分析,的原理和方法、进行序列分析前蛋白质和多肽样品的准备作一介绍。,第一节 N端分析原理,一、耦 联,蛋白质和多肽的自由,氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)试,剂耦联后，与其紧邻的第二个残基的键合力大大减弱，很容,易断裂。,二、裂 解,在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基。紧挨的,第二个氨基酸残基暴露出自由的,氨基，又可与PITC进行,耦联反应。,三、转 化,ATZ氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液(25)中可转化,成稳定的PTH氨基酸。,四、PTH氨基酸的鉴定,可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及,质谱等各种手段进行分析。近年来由于高效液相色,谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确,等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广,泛应用于PTH氨基酸的鉴定。通常选用C18反,相柱进行分离。,第二节 N端蛋白质序列仪,三、气相序列仪,自动化蛋白质序列仪刚问世时，需要样品量为12mg。1978年Tarr,等将一种四级铵盐聚合物“polybrene”引入了蛋白质、多肽的序列测,定，它能和肽链中的极性基团作用(非共价键合)而将蛋白质和多肽有效,地固定在玻璃纤维支持膜上，防止了萃取时样品的损失。为了适应分子,生物学对蛋白质微量分析的要求，20世纪80年代初，Hewick及,Hunkpillar等人改进了自动化蛋白质序列仪中的仪器结构，它用弹筒型,玻璃反应室(内部体积约0.05m1)代替了液相序列仪中的旋转玻璃杯，用,polybrene固定样品，Edamn降解反应中有的试剂如三甲胺以气体方式,输送，其他试剂以流动或液相脉冲方式输送。此仪器较之以前几种序列,仪具有以下明显优点：,灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需50100pmol；,试剂和溶剂消耗少，大约是液相序列仪的l10，降低了费用；,缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。,20世纪80年代末又对气相序列仪进行了部分改进，即将原来三氟乙酸,以气体方式输送改为液相脉冲方式，称为脉冲液相序列仪，以适应不同,样品的分析需要。另外，由于载有活性基团的功能性PVDF膜的问世，,蛋白质和多肽可以共价固定在此类膜上，直接在上述两种序列仪上进行,固相序列分析。,在这两种序列仪中，Edman降解后的PTH氨基酸衍生物可及时直接,从转化腔中自动输入高效液相色谱仪中进行PTH氨基酸衍生物的定性及,定量分析，这样不仅快速可靠，而且防止了样品的损失。这两台仪器统一,用电脑控制，包括化学反应和分析鉴定以及数据的自动记录和处理。图,4.2为标准PTH氨基酸的色谱分离图。由图可见，欲在20min内将各组分,较好分离，需选择合适的色谱条件，表4.1列出了各种条件的改变导致个,别组分位置的迁移及图谱的改善。,第三节 影响N端Edman反应裂解率的因素,在测序中往往可以发现，即使N端很均一的蛋白质(第一个循环出现单,个氨基酸残基)，经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。这是,由于Edman反应是一个化学过程，在其耦联、裂解、转化等步骤都有可,能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。目前最佳产率为9598,。因此，经过50次循环后，PTH氨基酸分析谱中将出现较多杂峰，,影响正确辨认，也就是说对于一般蛋白质最多能分析至N端第50个氨基,酸左右，欲知全顺序，则需将蛋白质降解成一系列肽段分析后再拼接。,对于有些蛋白质由于含有较多的对Edman反应敏感的残基或肽键，裂,解效率将更低。,循环至Ser和Thr时产率突然降低，这是因为在进行这两个氨基酸残基,分析前一个循环中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能与Ser和Thr上的羟,基反应，继而部分封闭Ser和Thr的N端氨基。,另外，丝氨酸和苏氨酸的PTI-汀生物也会部分转化成其他产物，造,成产率的降低。,耦联试剂PITC本身也将发生下列副反应，形成一些“杂质”。测序完成,后，电脑将每个循环的产率处理，得出起始产率(initial yield)和重复产,率 (repetitive yield)，其中通过起始产率可以估计蛋白质的真实含量，,有时可以推测N端是否封闭(和氨基酸组成分析测得的含量相差甚远)，而,重复产率则表明机器是否正常运转。另外，如果蛋白质或多肽中含有,过多的Ser、Thr、Glu、Trp等氨基酸残基，也将降低这两个数值。,第六节 C端序列分析,虽然建立在Edman化学法上的自动化N端测序技术日趋成熟，但仍,有不少问题需借助C端序列分析来解决。C端测序尤其适合于基因重组蛋,白是否正确表达的鉴定和大规模生产时的质量控制、N端封闭蛋白的分,析以及DNA探针的设计。,由于选择性对C端羧基进行耦联修饰并从C端逐一将氨基酸残基切下,较N端测序困难，在过去的近20年里，虽然为数不少的蛋白质化学家致,力于C端测序研究，但目前仍不能和N端测序技术程度媲美。蛋白质化学,工作者曾利用羧肽酶分析C端氨基酸残基，但是由于不同的羧肽酶对个,别氨基酸残基有选择性，使用时仍有一定困难。,最近，由于对化学法测定C端技术进行了一系列改进，已有了自动化C,端序列仪问世。所以介绍一种自动化C端测序方法的原理及应用。,一、C端分析原理,基于与N端Edman降解类似的原理，C端分析采用化学试,剂与蛋白质和多肽的,羧基反应，反应后的C端衍生物被,切割下来，通过HPLC系统进行分离分析。,一个完整的C端序列分析包括以下几个步骤：,(1)活化,蛋白质和多肽C端的自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐，并进一步,环化成嗯唑酮，而侧链上的羧基形成的混合酸酐难以成环。C端的嗯唑,酮在硫氰四丁铵的作用下，转化为乙内酰硫脲(thiohydantoin，TH)。,(2)酰胺化保护侧链羧基,侧链羧基形成混合酸酐后，与硫氰哌啶进一步作用形成酰,胺，以保护侧链。,(3)烷基化,由于C端环化形成的TH衍生物较为稳定而不易被切割，因,此产率不高。用溴甲基萘选择性地烷基化修饰硫原子，形成,Alkylated-TH(ATH)衍生物，裂解产率将大大提高。,(4)修饰Thr和Ser的羟基,蛋白质和多肽中的羟基会干扰测序，因此需要修饰。在活,化过程中，乙酸酐也会与羟基反应将其乙酰化，但反应不完,全，在N甲基咪唑(NMl)和乙酸酐的共同作用下，Thr和,Ser上的羟基基本被乙酰化。,(5)裂解和衍生,C端的ATH衍生物在酸性条件下与NCS反应而被,裂解生成ATH氨基酸，新的C端自动形成TH，而不必重新,活化。,因此，整个测序过程只需在开始时对C端进行一次性活,化，并修饰Asp和Glu侧链羧基以及The和Ser的羟基。实,际上，循环反应的只有烷基化和裂解两步，其全过程图解如,下图。,二、C端蛋白质序列仪,近年来，已有商品化的C端序列仪问世。C端序列仪一般,由N端序列仪改装而成，其基本结构与后者相似，两者的不,同之处主要在于：,反应所用的试剂不同，因此两者不可兼容，否则极易堵,塞管道；,在C端序列仪中，所有的化学反应均在弹筒型反应室中,进行，切割下来的ATHAA仅在转化腔内干燥和溶解后即,进入HPLC系统分离分析；而在N端测序仪中，ATZ AA需,在转化腔中转化为PTH-AA。,四、影响C端测序反应产率的因素,C端测序副反应较多，最高初始产率仅为20，而对于Glu，Asp，,Ser，Thr等氨基酸，其产率将更低。如C端富含上述几种氨基酸，测序,将十分困难。另外，一旦遇到Pro，由于吡咯环的存在而不能与乙酸酐,反应成环，整个测序过程将终止。,到目前为止，C端测序可测110个残基，一次测序需要的量比N端测,序要大得多，至少需1nmol。,此外，因为不同的氨基酸反应产率不同，所以，对图谱的分析也比N,端测序复杂，需要较多的经验。目前C端测序结果最好的一个样品是马,肌红蛋白原，可测C端10个以上残基，通常将其作为标准样品来判断仪,器的稳定性。,另外，由于副反应的存在，有的氨基酸将生成不止一种ATH衍生物。,如Arg的ATH衍生物可能被乙酰化或烷化；Tyr-ATH可被乙酰化；Cys,被修饰后将形成丙烯酰胺化的Cys-ATH以及脱氢Ala-ATH；脱水Thr-,ATH将产生两个非对映异构体。,五、结语和展望,目前，C端序列测序技术已初步成熟，并开始发挥作用。但其反应的,效率与N端Edman降解测序法有一定的差距。,因此，目前的主要问题是如何提高反应的产率，特别是如何改善T，,S，D，E几种氨基酸的测定，以及如何解决P终止测序的问题。如果在,上述几方面取得进展，将使C端可测残基数大大增加，并减少样品所需,量。另外，近年来发现，很多活性多肽的C端是酰胺化的，如果能检测,酰胺化的C端残基，将对活性多肽的研究有很大的帮助。,C端测序技术仍处于研究和发展阶段，虽然该技术还不尽完善，但对,于确认表达蛋白的C端是否正确，以及判断在表达、纯化过程中是否发,生了不必要的加工大有帮助。,