细胞生物学研究方法(5)课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 细胞生物学的研究方法,第一节 显微镜技术,（一）普通光学显微镜（Light Microscope）,组成,（1）光学放大系统（目镜和物镜）,（2）照明系统（光源、折光镜、聚光镜、滤光片）,（3）机械和支架系统,原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。,普通光学显微镜,尼康E600光学显微镜及组成部分,影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率（resolution）。,分辨率,是指能够区分相近两点的最小距离（R）。,人眼分辨率：100,m,R,图像,样品,光线,聚光器,物镜,影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率（resolution）。,分辨率,是指能够区分相近两点的最小距离（R）。,显微镜的几个光学特点：,通常,最大值,可达140，,sin/2的最大值必然小于1；介质为空气,中,N=1,；油镜头用香柏油为介质，N=1.515,普通光线的,波长为400700nm,，,因此，普通光镜的,最大分辨率,是,0.2m，人眼的分辨力为0.1mm,因此显微镜的最大设计倍数为500。,放大倍数=,显微镜的分辨率,人肉眼的分辨率,染色的原理,未染色,已染色,在普通光学显微镜下，细胞结构呈,半透明状,，不易看清。,往往将标本切片进行,染色,提高可辨程度,。,（二）荧光显微镜（Fluorescence Microscope）,倒置荧光显微镜,利用细胞中本身物质或运用荧光染料、荧光抗体，以紫外线激发荧光；,不同荧光物质激发光波范围不同，可发射不同颜色的荧光；,照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；,用滤光片滤去紫外线，因此只有荧光才能成像；,用于对物质进行定性和定量研究。,1-滤光片甲：仅让波长在450nm和490nm之间的紫外线通过,2-光束分离镜：反射波长510nm的光束可通过,3-滤光片乙：滤掉多余的荧光信号，让520nm560nm之间的绿荧光信号通过,（三）相差显微镜（Phase-contrast Microscope）,光通过不同密度物质时滞留的时间,不同，利用,相差板,，将,厚度,的差别转,化成,明暗,的差别，增加反差。,由荷兰物理学家,F. Zernike(1932),发明,：提高了活细胞结构的反差，从而解决了对活细胞观察的难题。,获诺贝尔物理奖(1953),通过致密部分(如细胞核),速度慢通过疏松部位(如细胞质),速度快,相位差,(光程差),振幅差,(明暗差),相差显微镜,活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化，这种差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并,利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差,来观察活细胞和未染色的标本。,相差显微镜下观察的有丝分裂实况,以波长比可见光短得多的,电子束,作为光源，用电磁透镜聚焦，电镜镜筒中要求高真空，图像用荧光屏（感光胶片）来显示（记录）；,分辨率可达,0.2nm,，有效放大倍数为10,6,倍；,结构,：,（,1）电子束照明系统（电子枪、聚光镜）,（2）成像系统（物镜、中间镜、投影镜）,（3）真空系统（两极真空泵）,（4）观察记录系统,二、电子显微镜技术,Ruska,(1932)便选择了,电子束为光源,来突破光学显微镜分辨率的极限，发明了,透射电子显微镜,(,transmission electron microscope, TEM,),。,电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，其波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。,V,1,各,种,光,及,电,子,束,的,波,长,透射电子显微镜,电 镜,光 镜,电子束,可见光,电磁透镜,玻璃透镜,电磁聚焦,机械聚焦,超薄切片,(0.05,m),石蜡切片,(110,m),光 源,透 镜,聚焦方式,切片厚度,图 像,彩色图像,黑白图像,电子显微镜与光镜的主要区别,电磁透镜,高真空,荧光屏,电子枪,电子显微镜与光镜的成像原理比较：,（一）透射电子显微镜,透射电子显微镜标本制备,由于电子束穿透能力有限，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有,0.05,m的超薄切片,，并放在铜网上。这种切片需要用,超薄切片机,制作。,超薄切片,铜网,莱卡超薄切片机,超薄切片技术,为便于电子穿透，获得高分辨率，需将样品切成极薄的薄片，即超薄切片技术（ultrathin section）。,内质网透射电镜图（伪彩色）,第二节 细胞的分离和培养,一、 不同类型细胞的分离,流式细胞技术,流式细胞仪,(flowcytometer,FCM),（荧光激活细胞分选仪）,对细胞进行自动分析和分选的装置,原理：,用带有荧光的特异抗体标记待分离的细胞，然后在流式细胞仪中从未标记的细胞中分选出标记细胞。,应用：,细胞分选:,1cell in 1000,2w-5w cells/sec,流式细胞仪,离心机,是借离心力分离液相非均一体系的设备。,根据物质的沉降系数、质量、密度等的不同，应用强大的离心力使物质分离、浓缩和提纯的方法称为,离心,。,离心原理,:,在离心力场的作用下，加速悬浮液中固体颗粒沉降（或漂浮）速度。,微粒在重力场下移动的速度,与微粒的大小、形态和密度,有关，并且又与重力场的强,度及液体的粘度有关。,离心技术 P44,离心是研究亚细胞成分和生物大分子的基本手段，将细胞器（细胞核、线粒体、高尔基体等）从细胞匀浆后悬液中分离出来。,转速为1025krpm/min的离心机称为高速离心机。,转速25krpm/min，离心力89Kg者称为超速离心机。,目前超速离心机的最高转速可达100krpm/min，离心力超过700,000g。,制备细胞匀浆,细胞,匀浆液,膜,细胞器,大分子,方法：,低渗透压,超声振荡,在细胞膜上打孔,强制通过微孔,机械破碎或研磨,差速离心（differential centrifugation）利用不同离心速度产生的不同离心力，将沉降系数不同的各种亚细胞组分和各种颗粒分开。,用于分离,大小、形状显著不同,的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离.,特点：,（1）介质密度均一；,（2）速度由低向高，逐级离心。,（一）差速离心,差速离心,高速,低速,密度梯度离心,密度梯度离心（density gradient centrifugation）：,将待分离的细胞组分铺放在,不连续介质,表面或内部，离心使细胞不同组分以不同速率沉降，形成不同,沉降带,。,类型：,速度沉降,；,平衡沉降,。,常用介质：蔗糖、多聚蔗糖、甘油、氯化铯 。,（二）速度沉降（,velocity sedimentation）,用途：,分离密度相近而大小不等,的细胞或细胞器。,原理：制备梯度离心介质（密度由顶部到底部逐渐增加）,分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降，形成不同的沉降带而达到分离。,梯度特点:梯度平缓，密度较低( 5%-20%)，,介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度,。,分离效率: 取决于,沉降系数,间的差异。,速度沉降,平衡沉降,（三）平衡沉降（equilibrium sedimentation）,用途：,分离,大小、形态相似而,密度不同,的组分。,特点：,（1）介质密度较高，陡度大,(20%-70%）,，,介质的最低密度应大于被分离组分的最大密度。,（2）所需的力场通常比速率沉降法大10100倍，往往需要高速或超速离心。,原理,：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并,停留,在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。,分离效率: 取决于,浮力密度间的差异,速度沉降,平衡沉降,高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在,体内(in vivo),的功能活动是十分困难的。显然，如果把活细胞拿到体外进行,体外培养(in vitro),来观察和研究，则要方便的多。,二、细胞培养（Cell culture）,活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存活和进行生理活动，否则就要死亡。因此，要进行体外细胞培养，就要尽可能满足细胞在正常体内生理状态下的各种条件，其中,选择最佳培养基是最关键的因素,。,定义：,细胞在体外的培养技术，即无菌条件下，从活体组织分离出特定细胞,模拟机体内正常生理状态下生存的基本条件，使之能够继续生存、生长以至增殖的方法。,细胞培养基本条件,1、合适的细胞培养基：,提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，培养细胞生长和繁殖的生存环境。,2、优质血清：,血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。,3、无菌无毒细胞培养环境：,在体外培养的细胞缺乏对微生物和有毒物的防御能力。,4、恒定的细胞生长温度,5、合适的气体环境：,气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。,克隆（clone）：,亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝,分裂产生的遗传性状一致的细胞群。,正常组织的初级培养物，细胞传代培养均有一定的限度，,只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去,。,所谓,转化,(transformation)即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有,癌性的细胞,。如HeLa细胞系（1951年从,He,nrietta,La,cks的宫颈癌细胞培养而成）。,通过细胞培养，世界上已建立了大量细胞株或细胞系,细胞系名称,细胞类型,来源,3T3,成纤维细胞,小鼠,HeLa,宫颈癌上皮细胞,人,BHK21,成纤维细胞,叙利亚仓鼠,PtKl,上皮细胞,袋鼠,L6,成肌细胞,大鼠,PCI2,嗜铬细胞,大鼠,SP2,浆细胞,小鼠,SP20,骨髓瘤浆细胞,小鼠,CHO,卵巢细胞,中国地鼠,细胞培养,在细胞生物学中是一项极为重要的实验技术，也是生物工程中不可缺少的重要手段。细胞生物学中有大量的生理生化方面的研究成果，都是通过细胞培养再结合其他技术取得的。,真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程,称为,细胞融合,(cell fusion)或,细胞杂交,(cell hybridization)。,基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon)；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)，通过有丝分裂，形成杂交细胞。,三、细胞融合,本章思考题,光学显微镜和电子显微镜的放大原理。,可以应用哪些方法观察细胞与亚细胞的微细结构，各有什么特点？,细胞培养、细胞融合、原代培养、传代培养、细胞株、细胞系的概念。,怎样进行细胞组分的分离？,