高分辨率溶解曲线HRM

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,SNP,及突变研究的最新工具高分辨率熔解曲线（,High Resolution Melting,）突变筛查和基因分型系统,北京思博全科技有限公司,内容提示,高分辨熔解曲线（,High Resolution Melting,）,高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用,筛查突变,（,mutation scanning,）,基因分型,（,Mutation Genotyping,）,小片段,+,内标法（,Small,Amplicon,Genotyping,）,非标记探针法（,Unlabeled Probe Genotyping,，,LunaProbe,）,SSR,分析,检测甲基化,HRM,仪器,High Resolution DNA Melting,（,HRM),是基于有序列变化的,Amplicon,之间微弱的,Tm,值差异，通过,DNA,片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：,PCR,Tube 1,Tube 2,Tube 3,Wild type,Homozygote,Heterozygote,LightScanner,突变检测原理,Lightscanner,高分辨溶解曲线结果,Saturating dye,LC Green plus,高分辨溶解曲线专用荧光染料,内容提示,高分辨熔解曲线（,High Resolution Melting,）的定义,高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用,筛查突变,（,mutation scanning,）,基因分型,（,Mutation Genotyping,）,小片段,+,内标法（,Small,Amplicon,Genotyping,）,非标记探针法（,Unlabeled Probe Genotyping,，,LunaProbe,）,SSR,分析,检测甲基化,HRM,仪器,Mutation Scanning,未知,SNP,扫描,M.H.Ye,等对北京油鸡,CAPN1,基因外显子进行扫描，筛查其潜在,SNPs,。,Bernhard J.,HoWnger,Hai,-Chun,Jing,Kim E. Hammond-,Kosack,Kostya,Kanyuka,(Barley Application),Theor,Appl,Genet (2009) 119:851865,DOI 10.1007/s00122-009-1094-2,数据来自英国洛桑农业实验站,Bernhard,等对,Barley,的,eukaryotic translation,initiation factor 4E (eIF4E) gene,基因外显子进行突变扫描结果,内容提示,高分辨熔解曲线（,High Resolution Melting,）的定义,高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用,筛查突变,（,mutation scanning,）,基因分型,（,Mutation Genotyping,）,小片段,+,内标法（,Small,Amplicon,Genotyping,）,非标记探针法（,Unlabeled Probe Genotyping,，,LunaProbe,）,SSR,分析,检测甲基化,HRM,仪器,Small,Amplicon,Genotyping,扩增小片段直接进行基因型鉴定,使用已知,Tm,值的双链,DNA,做温度内标，低温内标,Tm(61,) ,高温内标,Tm (,92 ),内标能够实现,96/384,孔板的温度均一矫正。,PCR,片段的,Tm,值范围：,70-88,优点：不需要探针，直接利用,PCR,产物针对已知突变位点进行基因分型,为何要使用温度内标,AT SNP,without,Calibration 72bp,Apply Temperature Calibration,AT SNP,with,Calibration,Small Amplicon Genotyping,M.H.Ye,等对北京油鸡,A-FABP,基因进行小片段法基因分型，扩增片段为,56bp,，灰色曲线显示的是杂合型（,CT,），蓝颜色和红颜色曲线分别代表纯合型,CC,和,TT,。,内容提示,高分辨熔解曲线（,High Resolution Melting,）的定义,高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用,筛查突变,（,mutation scanning,）,基因分型,（,Mutation Genotyping,）,小片段,+,内标法（,Small,Amplicon,Genotyping,）,非标记探针法（,Unlabeled Probe Genotyping,，,LunaProbe,）,SSR,分析,检测甲基化,HRM,仪器,HRM Lunaprobe genotyping,HRM Lunaprobe genotyping,1 Probe 1 SNP, All Possible SNPs,1 Probe 1 SNP, All Possible SNPs,Class 1 C:T, G:A,Class 2 C:A, G:T,Class 3 C:G,Class 4 A:T,1 Probe, 2 SNPs, 1 Amplicon,2 Probes, 2 SNPs, 1 Amplicon- ApoE,2 Probes, 2 SNPs, 2 Amplicons - HFE,Amplicon,Scanning ,发现新的突变,David De,，,Yong Song at,el.Application,og,high,-resolution DNA melting for genotyping and variant scanning of diploid and,autotetraploid,potato Mol Breeding (2010),25:6790,rr,RR,Rr,Mix,Rr:rr,by 1:1,Rrrr,Mix,RR:Rr,by 1:1,RRRr,内容提示,高分辨熔解曲线（,High Resolution Melting,）的定义,高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用,筛查突变,（,mutation scanning,）,基因分型,（,Mutation Genotyping,）,小片段,+,内标法（,Small,Amplicon,Genotyping,）,非标记探针法（,Unlabeled Probe Genotyping,，,LunaProbe,）,SSR,分析,检测甲基化,HRM,仪器,Rosario,Muleo,（,2009,）等用,HRM,方法对三个品种的,SSR DCA4,进行分析，,DCA4,的等位基因有,131bp,的重复序列，杂合等位基因的序列为,131-133bp,，分析结果如图,8,所示，,HRM,曲线可以将纯合样品和杂合样品明显的区分，其中一个等位基因只相差,2bp,。,三种颜色（浅灰，深灰、黑色）表明,3,种不同的品种。,Rosario,Muleo,等得出结论：,HRM,是一种快速、重复性高、成本低，操作简单，且可以应用于其他物种的,SNP,检测及,SSR,基因分型的方法。,Rosario,Muleo,Marir,Chiara,Colao,Dario,Miano,at el. 2009 Genome52:252-260,内容提示,高分辨熔解曲线（,High Resolution Melting,）的定义,高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用,筛查突变,（,mutation scanning,）,基因分型,（,Mutation Genotyping,）,小片段,+,内标法（,Small,Amplicon,Genotyping,）,非标记探针法（,Unlabeled Probe Genotyping,，,LunaProbe,）,SSR,分析,检测甲基化,HRM,仪器,内容提示,高分辨熔解曲线（,High Resolution Melting,）的定义,高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用,筛查突变,（,mutation scanning,）,基因分型,（,Mutation Genotyping,）,小片段,+,内标法（,Small,Amplicon,Genotyping,）,非标记探针法（,Unlabeled Probe Genotyping,，,LunaProbe,）,SSR,分析,检测甲基化,HRM,仪器,2005,LightScanner,96/384,96/384,孔板,8,分钟,/,板,2-6,秒,/,样品,温度均一性：,0.15,o,C,数据采集速度：大于,100pts/,秒,升温速度：,0.1,o,C/,秒,2010,LS32,32,样品转盘,玻璃毛细管,HRM,检测,60,分钟内完成定量,PCR,和,HRM,检测,HRM,检测升温速度可以在,0.05,0.90,o,C/,秒之间调节,在升温速度小于,0.3,/,秒时，温度均一性：,0.05,o,C,数据采集速度：,20pts/,秒,400pts/,秒（与升温速度有关）,0.3,o,C/,秒 升温速度,= 67 pts/ ,0.05,o,C/,秒 升温速度,= 400 pts/,LightScanner,高分辨溶解曲线应用,LunaProbes,非标记探针基因分型,未知,SNP,扫描,Small,Amplicon,小片段基因分型,HRM,分析流程,在,PCR,反应前加入,LCGreen,荧光染料,时间大约,2,小时（包含试剂准备）,在,LightScanner,上进行高分辨溶解曲线分析,大约需要,5-10,分钟,数据分析和处理,大约需要,5-10,分钟,PCR,产物可以直接进行下游的测序分析等（如需要）,大约需要,30-60,分钟,LightScanner,适于,SNP,分析,速度、通量,LightScanner,5,10,分钟完成,96/384,孔板的,PCR,产物检测，,20000,个,SNP/,天,可检测未知、已知突变，对已知突变进行,Genotyping,检测未知及已知突变准确性,100%,、特异性,92.7%,（,400bp,）,重复性,LightScanner,重复性,100%,费用,LightScanner,检测,SNP,每个样品的荧光染料成本为,1.6RMB,操作,LightScanner,只需将,PCR,产物（,96/384,孔板）放入仪器内便可，软件自动基因分型，,PCR,产物不需要处理,谢谢！,