电子克隆简介

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,电子克隆简介,1,什么是电子克隆,拼图游戏一样的原理,应用,如何做拼图游戏,常用软件及网络资源简介,优点与缺点的讨论,现状与展望,2,什么是电子克隆,Watson & Crick 成功解析了DNA分子二级结构，开创了,分子生物学时代,Karry Mullis 发明了PCR反应，体外,大规模,、,有目的,和,快速地,克隆目标基因成为可能,信息科学技术特别是数据库技术在战后飞速发展,3,什么是电子克隆,表达序列标签,（,expressed sequence tags，EST,）是对某个基因cDNA克隆测序所得的部分序列片段，长度大约为200600bp,由于基因,表达调控作用,不同，同一个基因的mRNA,剪接位点和方式,不同，所以同一个基因的全长cDNA可能包含多个EST,EST既代表了基因cDNA的某一区段，也表征了成熟mRNA可能的剪接方式,4,什么是电子克隆,电子克隆技术是生物学数据库中EST数据库、核酸序列数据库、基因组数据库，采用同源性序列比对和归类分析、重叠区域,组装,和,拼接,等方法延长EST序列，直至没有与之同源的序列可供拼接为止，所得到的序列可以认为是相对应基因的,全长cDNA,，根据所得的cDNA序列设计囊括开放阅读框两端的引物，进行RT-PCR克隆出相应基因的方法,5,什么是电子克隆,传统的克隆方法是利用基因特异性引物大量扩增cDNA末端或构建cDNA文库并采用原位杂交进行筛选，,实验进程长、步骤繁琐、成本高、得率低,；运用电子克隆的方法延伸得到的cDNA几乎囊括了所有疑似为目的基因的cDNA序列，无论表达转录如何调控，都能通过PCR扩增出表达的那一段基因,传统的方法如同小规模地捕捞一条或几条鱼，电子克隆与之相比就如同集约化地捕捞一群鱼,6,拼图游戏一样的原理,相近的物种在核酸序列上有相似性，相近物种中的,同源基因,序列在一定程度上可以代表目的基因的序列,可代表程度与两序列的相似度直接相关，加之遗传密码的简并性，这种混同在理论上是可行的 ，但需要作,同源性检验,以克服主观因素的影响,7,拼图游戏一样的原理,借助计算机找到具有相同或相似图案的图块，拼成完整的图案，我们需要做的是进行局部的微调。,剩下的工作就是对拼接出的cDNA进行可能的开放阅读框的分析，设计囊括开放阅读框两端的引物，RT-PCR扩增侯选基因,8,应用,电子克隆主要应用于两个方面：,一个是利用EST序列检索同源性序列，并由此拼接cDNA序列以期挖掘新基因,另一方面是在全基因组已经测序的物种中，研究整个基因组序列以推测其中可能尚未发现的基因,目前应用比较广泛的是第一方面,9,应用,数据库查询,数据库比对,文件下载,序列分析,序列装配,分子模型,结构分析,功能分析,10,应用,在全基因组已经测序的物种中推测新基因的步骤如下：,分析和定位开放阅读框,虚拟翻译并对多肽链序列检索比对,可靠性检查,分析与之相关的调控序列,11,如何做拼图游戏,以电子克隆新的水稻,过氧化氢酶,（catalase，CAT）基因为例，简介延伸cDNA的流程：,以登录号为CA759712的EST在对其在核酸序列数据库中进行BLAST检索比对时，发现登录号为,CB652681,的序列推测为水稻,CAT,基因的部分序列，与信息标签 EST具有比较高的同源性，该EST序列将作为种子序列,12,如何做拼图游戏,将检索得到的同源序列保存到PC机上，运行DNAStar软件包，将上述序列输入，由于基因测序是借助质粒载体完成的，序列中难免混有载体序列，因此需要运行程序查找载体序列，对序列进行末段,修剪,去掉冗余部分,13,如何做拼图游戏,程序根据外显子和内含子的编码规则和排布方式搜索和,定位开放阅读框,，开放阅读框是电子克隆的重点研究对象；接着，程序对各段序列的重复序列和差异序列进行逐一检索和比对，并对重叠区域进行,拼接和组装,，构建重叠序列群,以上各步骤由程序自动完成,14,如何做拼图游戏,以构建的重叠序列群为信息标签，进一步检索比对，搜索其高度同源序列,如果发现了与之高度同源的未知序列，则重复上述步骤；若没有新的发现，说明拼接组装得到的EST可能囊括了所以可能的目的基因序列,根据以上步骤，得到了一个全长为1678 bp的EST序列,15,如何做拼图游戏,以此EST序列为cDNA序列，对其设计囊括整个开放阅读框的特异性引物，设计得到的上游引物为：5-CTA-GCC-CAC-TAC-CAT-GGA-TCC-TTG-3，下游引物为：5-CAG-AAT-TTC-TGT-AGC-CTT-GCT-GAT-3，,引物的具体合成可交由经营分子生物学相关产业的公司商业化合成,16,如何做拼图游戏,对延伸出的cDNA其作,人工,的可靠性验证,提取水稻中总RNA，进行RT-PCR，电泳检测结果,转录调控的研究,17,常用软件及网络资源简介,DNAStar是一款电子克隆中常用的软件包，它以功能全面和强大而著称，它主要包括以下几个应用程序：EditSeq、GeneMan、GeneQuest、MapDraw、MegAlign、PrimerSelect、Protean、和SeqMan II,18,常用软件及网络资源简介,EditSeq是输入并且修剪DNA或蛋白质序列的工具。EditSeq能读取大部分的序列格式，也可以通过使用键盘输入，或者从其他地方复制、粘贴得到。序列被打开后，EditSeq能使用标准或者指定的遗传密码进行翻译或反翻译、寻找开放读框以及进行阅读校对,19,常用软件及网络资源简介,GeneQuest可以发现注释DNA序列中的基因，并提供相关的参数，包括ORF、拼接位点、转录因子结合位点、重复序列、限制性内切酶酶切位点等。通过应用“methods”命令，序列的各项相关信息和参数可以以图形的形式展示出来。,20,常用软件及网络资源简介,MapDraw可以制作简单的线性图到有注释的环形图，在展示限制性酶切位点的同时，还可以同时展示序列的feature、开放阅读框及其翻译结果。MapDraw工具主要应用与规划酶切位点和克隆实验，产生详细和充分的结果概括,21,常用软件及网络资源简介,MegAlign提供了比对方法，进行DNA和蛋白质序列的配对和多序列比较。多序列比对可以在MegAlign的工作界面中进行查看和编辑。可以根据队列的结果制作进化树，有关序列距离的数据和残基替代可以作成表格,22,常用软件及网络资源简介,PrimerSelect能够辅助设计引物和探针。输入DNA、RNA 或反向翻译的蛋白质模板序列后，PrimerSelect可以在计算序列的各种参数，用户可以通过控制各种参数限定计算结果。在模板处理后，PrimerSelect按照用户定义的参数确定引物的位置，并给引物评分，然后筛选出模板序列上的最佳引物序列。,23,常用软件及网络资源简介,美国国家生物信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI），,美国冷泉港实验室（Cold Spring Habor Laboratory，CSHL），,欧洲分子生物学信息网（European Molecular Biology Net，EMBnet），,24,常用软件及网络资源简介,欧洲分子生物学实验室（European Molecular Biology Laboratory，EMBL），,日本国立遗传研究所（National Institute of Genetics，NIG），,北京大学生物信息学中心（Peking University Center of Bioinformatics，PKUCBI），,25,优点与缺点的讨论,与传统的基因克隆方法相比，电子克隆有以下的优点：,简便快速，成本低廉，设备简单,对操作人员技术要求不高,成功率高,26,优点与缺点的讨论,尽管电子克隆在理论上已没有什么障碍，然而在实际操作中依然存在些不足之处：,电子克隆得到的cDNA序列是由计算机虚拟出来的，,现实中可能并不存在,研究人员不可完全迷信软件提供的结果，最好对分析做,人工,可靠性验证,普遍适用性较差,电子克隆后需要研究其指导合成的蛋白质的功能才更有实际意义,27,现状与展望,国外的科研人员做了许多有益的贡献，特别是水稻、拟南芥等全基因组测序完成后，借助软件分析，从中发现和克隆了一系列全新的基因,我国的研究人员也进行不少的具有建设性和创造性的探索和尝试，也取得了令人鼓舞的成果,28,现状与展望,随着科学技术的不断发展，以及数据库准确性的逐渐提高，电子克隆的两大制约因素，,辅助设计软件,和,数据库,将日臻完善，电子克隆技术将日趋成熟。,电子克隆技术有可能从根本上改变人们对与基因克隆的看法，改变基因克隆长久以来沿用的策略，改变科研人员关注焦点，促使研究人员致力与生物大分子的功能，以更好的造福于全人类,29,Thank you for your patience!,30,