第五章电泳技术

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第五章 电泳技术,第一节,电泳基本概述,肝素的鉴别采用糖凝胶电泳法：,肝素是由,D-,硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间组成的酸性粘多糖，其水溶液带强负电荷，于琼脂凝胶板上，在电场作用下，向正极方向移动，与肝素国家标准品对照，其移动位置应相一致。,样品脱盐后等电点聚焦法测定,:,测定药物的等电点（为出现多条区带多个等电点），同批次同一产品的等电点应相同，表明其工艺稳定。,掌握电泳技术的基本原理。,掌握,PAGE,不连续系统的原理与技术。,掌握,SDS-PAGE,测定蛋白质分子量的原理和技术。,学习电泳前沿技术等电聚焦电泳、双向凝胶电泳电泳、毛细管电泳原理及应用。,了解电泳相关技术的原理及应用。,教学目的,发展概况,1809,年物理学家,首次发现电泳现象,.,1909,年,Michaelis,首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳（,electrophoresis,）,.,1937,年,Tiselius,创造了,Tiselius,电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及,、,、,球蛋白组成的,.,1948,年,Wieland,和,Fischer,重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的进行分离。,50,年代起，利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。,1959,年,Raymond,和,Weintraub,利用人工合成的凝胶作为支持介质，开创了近代电泳的新时代。,80,年代发展起来的新的毛细管电泳技术。,70,年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：,1,、提高分辨率及灵敏度。,2,、简化操作，缩短电泳时间。,3,、扩大应用范围。,1.,电泳技术的基本原理,电泳：,带电粒子在电场中的定向移动。,被分离物质的两性特性：,电泳法,:,指带电微粒如蛋白质、核苷酸、其他微粒分子或离子在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度泳动而使组分分离，再进行检测或计算百分含量的方法。,颗粒在溶液中迁移的驱动力：颗粒的有效电荷和电位梯度。他们与介质的摩擦力抗衡，在自由溶液中，这种抗衡服从斯托克斯定律,:,F=6rv,F,摩擦力,r,颗粒的半径，,v,移动的速度，,介质的黏度,.,V,:,泳动速度,cm/,秒,or,分,d,:,泳动距离,cm,t,:,电泳时间,(,秒,/,分,),E,:,电场强度 伏特,/cm,u,:,泳动率,or,泳动度,(cm/,伏,秒,or,分,),U,:,电压 常压,(100,500v),高压,(500,10000v),仅需几分钟,l,:,支持场的长度,(,有效长度,),迁移率,(mobility),：,带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度,.,影响电泳速度的因素,颗粒性质,:,直径、形状、静电荷。,电场强度,:,电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快常压：,2-10V/cm,溶液性质,:,电极溶液和蛋白质样品溶液,pH,、离子强度,(,最适:0.02,-,0.2,),、溶液黏度。,电渗,:,液体对固体支持物的相对移动,。颗粒运动的方向与电渗方向一致时，加快颗粒的迁移率。反之亦然。,焦耳热,:,筛孔,:,（一）按支持物物理性质分类,：,滤纸及其他纤维素,：,醋酸纤维素,、,玻璃纤维等,凝胶电泳,：,琼脂,、,聚丙烯酰胺凝胶等,粉末电泳,：,淀粉、纤维素粉、玻璃粉,线丝电泳,：,微量电泳,二、电泳法的分类,（,二）,按电泳法的基本原理分,:,1、自由界面电泳：在一根,U,形管里的溶液中，同种分子的构型及荷电情况基本一致，在电场影响下，它们逐渐密集而与其他电泳迁移率不同的物质之间形成明显的界面。,2,、高效毛细管电泳法（,HPCE,）,:,是根据带电组分在管中由于其所带电荷和分子量的大小，即荷质比不同产生不同的迁移速度而分离。,3,、区带电泳：在电泳过程中，应用各种不同的惰性支持介质，在电场作用下，使具有不同泳动速度的组分形成各自区带的电泳。常用的支持物有：滤纸、醋酸纤维素薄膜、聚丙烯酰胺凝胶（,PAGE,）、十二烷基硫酸纳,-,聚丙烯酰胺凝胶（,SDS - PAGE,）。,第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,PAGE）,是以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的区带电泳,；PAGE,是目前最常用的电泳方法。,一、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层、缓冲液离子成分、,PH、,电位梯度均不连续），使样品在不连续的两层凝胶之间积聚浓缩成很窄的样品区带（厚度为0.1毫米），然后再进行分离，从而提高了分辨率。,聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点,设备简单,样品量小（1-100微克）,时间短（30-60分钟）,操作方便,分离范围广（多肽，蛋白，多糖等）,可提高灵敏度改为超微量测定（10,-12,10,-9,）,可用于蛋白质分子量,二、聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备,1.,性能:,稳定、机械强度好、纯度高,.,制备原理：,2.1,制备原料：,丙烯酰氨（,Acr),，亚甲基双聚丙烯酰胺,(Bis),聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺,(acrylamide，简称Acr),和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺,(N,N,-,methylene,-,bisacylamide,简称Bis),在加速剂,N,N,N,N,-,四甲基乙二胺,(N,N,N,N,-,tetram,-,ethyl ethylenedia mine，简称TEMED),和催化剂过硫酸铵,(ammonium persulfate (NH,4,),2,S,2,O,3,，简称AP),或核黄素,(ribofavin即vita min B2,C,17,H,2,O,6,N,4,),的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳,(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE),。,光聚合,：,核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。,化学聚合：,制小孔胶。,过硫酸铵(NH,4,),2,S,2,O,3,APS,(引发剂),N,N,N,N,-,四甲基乙二胺,TEMED,(加速剂),2.2,聚合方式,聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺（,acrylamide,）和,N,N-,亚甲基双丙稀酰胺（,N,N-methylene bis acrylamide,）经共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（,tetramethylethylenediamine,，,TEMED,）和过硫酸胺（,ammonium persulfate,，,AP,）激发的。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。,NH,CH,2,=CH,CONH,2,+,CH,2,=CH,C,CH,2,=CH,C,CH,2,CH,CH,2,CH,x,CH,2,CH,2,CH,CH,2,CH,x,CH,2,CONH,2,C=O,CH,2,NH,NH,O,O,CONH,2,C=O,NH,CH,2,丙烯酰胺,N,N,-,甲叉（亚甲基）双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺,反应方程式,：,3凝胶浓度和交联度与孔径的关系,凝胶浓度（,T）：,丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的总百分浓度。,交联度（,C）：,有效孔径取决于凝胶总浓度,T%，,有效孔径随,T%,的增加而减小。,有效孔径决定蛋白质的分离,特别注意,丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺对中枢神经系统有损伤作用.,丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺要避光保存.,混合的溶液保存不宜超过一个月.,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种物理效应,样品的浓缩效应,凝胶的分子筛效应,电荷效应。,样品浓缩效应：,由凝胶系统的不连续性产生。,凝胶孔径不连续性,缓冲液离子成份的不连续性,PH的不连续性,凝胶孔径不连续性,单体浓度,交联度,大孔胶,:T=3% C=2.0%,小孔胶,:T=7% C=2.5%,凝胶网孔大小,:,聚合链长度,:,由,Acr,浓度,交联程度,:,由,Acr,与,Bis,相对比例,Bis,的浓度低,孔径大,可在聚合前调节单体与,Bis,的浓度比,如,: Acr Bis T(%),小孔,28.0g 0.735g 7%,大孔,10.0g 2.5g 2.5%,蛋白质在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。到分离胶的界面时，由于分离胶的孔径小阻力大，速度就减慢了。由于其不连续性，在大孔与小孔凝胶的界面处样品得到浓缩，区带变窄。,凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。,分子量范围 适用的凝胶浓度/(%),蛋 白 质,5,10,5,2-5,核酸(RNA), Pr,-, Gly,-,(Pr被压成薄层),在大孔胶中：,要求,Gly,的有效迁移率低于所有,Pr,，经计算,pH=6.7,。,在小孔胶中：,要求,Gly,超过所有,Pr,，,Pr,留在后面进行普通的电泳与分子筛分离分成多个区带。,(,此,PH,实测为,9.5),上、下槽缓冲液,(TrisGly,，,pH8.3),、浓缩胶缓冲液,(TrisHCl,，,pH6.8),、分离胶缓冲液,(TrisHCl,，,pH8.8),，两种凝胶的浓度,(,即孔径,),也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的,HCl,几乎全部解离成,Cl,，两槽中的,Gly (pI,6.0,，,pK a=9.7),只有很少部分解离成,Gly,的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。,C1,速度最快,(,先导离子,),，其次为蛋白质，,Gly,负离子最慢,(,尾随离子,),。由于,C1,很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和,Gly,离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。,分子筛效应,蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其,pH,升高,(,电泳进行时常超过,9.0),，使,Gly,解离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。此两项变化，使,Gly,的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的,pH,和电压梯度环境中，按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。,三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高。,一般电泳分离的电荷效应,带电多，MW小，迁移快,不连续系统对样品的浓缩效应,迁移率,被压成薄层,凝胶对样品分子的筛选效应,三、聚丙烯酰胺凝胶电泳的装置,理想显色剂的,7S,安全（,safety,）：,灵敏（,sensitivity,）：,简单（,simplicity,）：,特异性（,specificity,）：,快速（,speed,）：,稳定（,stability,）：,兼容性（,synergy,）：,四、电泳后的检测,考马斯亮蓝,R250,：,灵敏度是氨基黑,10,B,的,5,倍，但不适用与酸溶蛋白、醇溶蛋白。,考马斯亮蓝,G250,：,灵敏度不如,R250,，但不溶于酸性溶液，本地无色。,考染灵敏度为,30100ng,，线性范围是,20,倍,.,银染法：,机制：将蛋白质带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使银颗粒沉积在蛋白带上。银染蛋白的吸光度与他们的浓度成线性关系。,蛋白质的染色程度与蛋白质上的特殊基团有关，碱性和含硫氨基酸的存在对染色有贡献。,银染应先固定，固定的作用有两个：第一是把蛋白质固定在凝胶中阻止扩散。第二为了除去干扰染色的物质，如去污剂、还原试剂和缓冲液中的成分（甘氨酸）。固定剂有戊二醛、乙醇、甲醇醋酸、三氯醋酸。,染色分为双胺银染和非双胺银染。,银染的线性范围是,40,倍，灵敏度是考染的,100,倍。,双胺银染过程：,1.,胶在,50%,甲醇中浸泡至少,1,小时,.,2.,配制溶液,A 0.8,克硝酸银到,4,毫升无离子水。,B21,毫升,0.36%,氢氧化钠和,1.4,毫升,14.8,摩尔的氢氧化胺,.,3.,将,A,滴到,B,中，用无离子水加至,100,毫升，此溶液临用前配制，染色,15,分钟,.,4.,无离子水漂洗,5,分钟,.,5.,显色液：,2.5,毫升,1%,柠檬酸与,0.25,毫升,37%,甲醛混合，加无离子水至,500,毫升。显色约,10,分钟，蛋白带出现。,6.,无离子水漂洗后用,50%,甲醇终止显色。,ANS,法：,1-,苯胺基,-8-,萘磺酸，,本身无荧光，与蛋白结合后产生荧光，电泳后，取胶置平皿中，用此染料溶液浸,1-3,分钟，在紫外灯下观察，黄色。检测限,100,微克，如果不明显，将胶取出暴露空气中或浸在,3,摩尔盐酸溶液中两分钟，使蛋白表面稍变性，然后染色，检测线提高，,20,微克。染色后酶和抗体能保持活力。可用来测定酶活或者作抗原注射动物。,氨基黑,10,B,法：,是一种酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。氨基黑染料染,SDS-,蛋白质效果不好。,染不同蛋白时，色度不等，色调不一（蓝、黑、棕），纯度扫描时误差太大。,负染,:,表现为胶面着色而蛋白质点透明。速度快（,515min,），蛋白质的生物活性能保持,该技术主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的使用。,胶体扩散染料,:,用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和,PVDF,膜上的蛋白质，不用于胶内染色。这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。,机荧光团染料,:,包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。其典型代表是已经商品化的,SYPRO Red,、,Orange,、,Ruby,等荧光染料。,金属螯合染料,:,很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合。,第三节,SDS-PAGE,概述：,1967年建立，1969年完善。,在样品和聚丙烯酰胺凝胶中加入,SDS,后，蛋白质分子的迁移率就取决于它的分子量大小，因此可用来测定分子量。,几种电泳方式的比较：管状凝胶电泳，垂直板凝胶电泳，水平薄层凝胶电泳。,SDS,电泳的原理,SDS,的性质：,表面活性剂、带负电。,蛋白质的形状：,球状、线状。,SDS,与蛋白质结合后的状态：椭圆棒,蛋白质的分子量仅与长度有关。,SDS,是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质,-SDS,复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种聚丙烯酰胺凝胶电泳方法称为,SDSPAGE,。,影响蛋白质与,SDS,的结合程度的因素,溶液中,SDS,单体的浓度,样品缓冲液的离子强度,二硫键是否完全被还原,SDS,聚丙烯酰氨凝胶的组成与聚合,凝胶分为均匀胶和梯度胶两种.,梯度胶可提高蛋白质分子量的分离范围：,10%-15%,适合于,1-25,万,MW,配胶时：,1.,丙烯酰胺的质量,2.,尽量减少,AP,，,TEMED,的量,.,3.,控制聚合时间（,40-60,分钟）温度,30-50,度,4,室温放置,12,小时,样品的制备,样品缓冲液的组成：甘油，溴酚蓝，还原剂（,DTT,）,，,SDS,，,TRIS-HCL,样品处理：加热变性,特殊样品的处理：,上样浓度：,考马斯亮蓝染色：2030纳克/微升,银染： 0.30.5纳克/微升,SDS-PAGE测定蛋白质分子量,原理,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。,1967年，Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。,原理,蛋白质Pr溶液中 加巯基乙醇,加SDS,打开氢键与疏水键,复合物,1.4g ： 1g,加入SDS为SO4-2改变了Pr的荷电性质.,各种SDS-Pr均带相同密度的负电荷，其荷电超过了原Pr，消除了不同Pr荷电差异。,加入SDS，改变了Pr的构象，SDS-Pr为长椭圆棒，各种短轴约为1.8nm。,长轴：Mr，均呈正比例，所以,常数 斜率 迁移率,相对迁移率mR=样品迁移距离cm/染料迁移距离cm,标准曲线,MW=K（10bm ）,1gMW=1gKbmR=K1bmR,式中：MW为蛋白质的分子量；K，K1为常数；,b为斜率；mR为相对迁移率。,影响迁移率的因素,二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。,影响迁移率的因素,溶液中SDS的浓度：溶液中的SDS的总量，至少要比蛋白质的量高3倍，一般需高达10倍以上。,溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不能超过0.26，因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS单体具有较高的平衡浓度。,影响迁移率的因素,在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制得完全一致，因此，用SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。,实验程序,试剂及仪器,实验程序 ：,配胶,电泳,染色,脱色,扫描,电泳装置,图,2,夹心垂直板电泳槽示意图 图,3,凝胶模示意图,1.,样品槽模板,2.,长玻璃板,1.,导线接头,2.,下贮槽,3.,凹形橡胶框,4.,样品槽模板,5.,固定螺丝,6.,上贮槽,7.,冷凝系统,试剂,丙烯眈胶凝胶贮备液：,取3Og丙烯肮胶(Arc)和0.8g双丙烯眈胶(Bis)溶于双蒸水中，并定容至100mL。过滤后4下贮存备用，可保存1,-,2个月。,10%过硫酸镀：,称取过硫酸镀(NH,4,),2,S,2,0,8,(APS)lg，溶于10mL双蒸水中，用前配制1.5mol/L TIts-HCl，pH8.8。,分离胶缓冲液：,称取18.15gTIts，用60mL双蒸水溶解，再用4mol/L盐酸调节至pH8.8，然后定容至100mL，4保存0.5mol/L TIts-HC1,pH6.8。,试剂,浓缩胶缓冲液：,称取6gTIts，用6OmL双蒸水溶解，再用4mol/L 的盐酸调节至pH6.8，然后定容至100mL，4保存。,10%SDS溶液：,取lOgSDS溶于80mL双蒸水中，并轻缓搅拌(室温低时需水浴溶解)，再定容至100mL，室温存放。,样品缓冲液(样品溶解液)：,分别取双蒸水 4mL，0.5mol/LTEts,-,HC1，pH6.8缓冲液1.OmL，甘油0.80mL，10%(质量浓度)SDS1.6mL，疏基乙醇0.4mL，0.1%(质量浓度)澳盼蓝0.2mL，总体积为8mL，4保存。,电极缓冲液：,称取3gTIts，14.4g甘氨酸，lgSDS，用水溶解后，定容至1000mL，pH8.3，不必调节。,试剂,染色液：,取1g考马斯亮蓝R250，溶于250mL甲醇及100mL冰醋酸中，溶解后定容至100OmL。,脱色液：,250mL甲醇(或乙醇)和100mL冰醋酸混匀后，定容至 100OmL。低Mr标准蛋白质混合物(兔磷酸化酶B97400；牛血清白蛋白 667；兔肌动蛋白43000；牛碳酸野酶31000；膜蛋白酶抑制剂20300； 鸡蛋清溶菌酶14400)。,蛋白质样品的处理,标准蛋白质样品的处理：取成套的标准蛋白质系列加入20L样品溶解液，使之充分溶解后置沸水浴中加热3min，取出冷却。,待测蛋白质样品处理：取小牛血清白蛋白0.1mg 及膜蛋白酶0.2mg或其他待测样品(作为未知样品)分别溶解于20,-,50L样品溶解液中，置沸水浴中加热3min，取出冷却至室温。,电泳,上槽接负极，下槽接正极，然后打开电源开关立即进行电泳，开始时电流控制在10A，待样品从浓缩胶进入分离胶后，将电流调节至20,-,25A，在整个电泳过程，电流维持不变，当指示染料澳盼蓝迁移至距下沿1cm左右，即可停止电泳，整个电泳过程约需4h左右。,剥胶与染色,电泳结束后，关闭电源开关，从电泳槽中取下凝胶板并卸下硅胶框，用带细长针头的注射器吸满蒸馏水，将针头插入凝胶与玻板之间，沿玻板缓缓移动，并缓缓将蒸馏水注人，最后注入少量空气，取出针头，将两玻板轻轻揭开后即可取出凝胶板，将之置培养皿中，冲洗胶面后，加入染色液，染色5h或过夜。,染色,结果与分析,绘制标准曲线,将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距细铜丝间的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm），如图18-6所示。按下式计算相对迁移率mR：,相对迁移率mR=,蛋白质样品距加样端迁移距离,(cm),溴酚蓝区带中心距加样端距离,(cm),结果与分析,以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。,根据未知蛋白质样品相对迁移率直接在标准曲线上查出其分子量。,当蛋白质的分子量在,15-200kD,之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。,标准Marker蛋白的电泳图谱,有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。,SDS,电泳测定分子量的局限性,不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。这些蛋白质有：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。,例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。,用,SDS-PAGE,测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。而且每次都要同时用作标准曲线，现做现用，不可相互挪用。,SDS-PAGE,测定分子量有,10,误差，不可完全信任。,SDS,与蛋白质的结合成比例（即：,1.4gSDS /g,蛋白质），蛋白质含量不可过量，否则,SDS,结合量不足，会使测量结果出现偏差。,如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是,SDS,不纯引起。,第四节 琼,脂 糖 凝 胶 电 泳,Agarose Gel Electrophoresis,天然琼脂（,agar）:,又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。,琼脂糖（,agarose）,琼脂胶（,agaropectin）,在电场作用下能产生较强的电渗现象,琼脂糖,半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷,D-,半乳糖,3，6-脱水-,L-,半乳糖,琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。,琼脂糖凝胶的,特点,（一）优点,1.,因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗,2.,对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。,3.,凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。,4.,透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。,5.,不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定,6.有热可逆性,（二）缺点,1.,机械强度差，易破碎，浓度不能太低。,2.,易被细菌污染，不易保存，临用前配制。,3.,琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。,4.与,PAGE,相比，分子筛作用小，区带少。,应 用,适用于大分子的核酸、核蛋白、多糖等的分离、鉴定及纯化,