第二章-紫外可见分光光度法-2

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二节朗伯比尔定律,一、朗伯比尔（,Lambert-Beer,）定律,Beer,定律：吸光度与吸光物质浓度,C,成正比,Lambert,定律：吸光度与吸收池厚度,L,成正比,Lambert-Beer,定律：,A=ELC,（,1,）吸光度,A,（,2,）,吸光系数,E,（,3,）厚度,L,单位：,cm,（,4,）,浓度,C,单位：,mol/l,或,(% g/ml),1,、几个基本概念,（,1,）吸光度,A,含义,当一束平行单色光通过均匀、非散射溶液时，用,A,表示溶液对光的吸收程度，,T,为透光度或透光率，,T= I,t,/ I,0,，是百分数；,I,0,I,a,I,t,吸光度具有加合性,吸光度,A= -,lgT,=,lg,I,0,/ I,t,=ELC,（,2,）吸光系数,物理意义,影响因素,表示方式,表示吸光物质在单位浓度及单位厚度时吸光度：,A=ELCE=A/LC,物质的本性；单色光的波长；温度；溶剂,注：,若单色光的波长、温度、溶剂一定，即不同的物质对同一,波长的单色光，可有不同的吸光系数,吸光系数的表示方式,摩尔吸光系数：,或,E,M,标记,一定波长时，溶液的浓度为,1mol/l,，厚度为,1cm,的吸光度,百分吸光系数或比吸光系数：,E,1cm,1%,一定波长时，溶液的浓度为,1%(g/ml),，厚度为,1cm,吸光度,.,注：,两种表达式之间的关系：,=M,.,E,1cm,1%,/10,(M,为吸光物质的摩尔质量，根据,mol/1000mlg/100ml),摩尔吸光系数一般不超过,10,5,数量级，通常在,10,4,-10,5,之间为强,吸收，小于,10,2,为弱吸收，介于两者之间为中强吸收,吸收系数不能直接测量，需由所测得的吸光度换算而来。,在实际分析过程中，通常固定吸收池的厚度不变，用比色计或分光光度计测量一系列标准溶液的吸光度，根据,A=ELC=KC,，以,A,为纵坐标，,C,为横坐标，将会得到一条通过原点的直线：,但实际工作中,经常发现标准曲线不成直线的情况,.,如图,(1),光学因素,(2),化学因素,非单色光,杂散光,散射光和反射光,非平行光,溶液中的化学反应。,如,:,溶液中的吸光物质常因离解,;,缔合,;,形成新的化合物或互变异构等化学变化而改变溶液的浓度导致偏离,Bear-Lambert,定律,.,由于介质不均匀引起的偏差,。被测试液是胶体溶液,;,悬浊液,;,乳浊液等,.,2,、偏离,Lambert-Bear,定律的原因,非单色光,Lambert-Bear,定律的一个重要前提是单色光，但事实上真正的单色光是难以得到的。,如在分光光度计中，从光源发出的光不是真正的单色光，而是包括了所需波长的光和附近波长的光，即：有一定波长范围的光，这一宽度称为波谱宽度,(band width),，常用半波宽来表示，其半波宽,S=,2,-,1,半波宽,S,，单色性越好，仪器越精密。,back,其他光学因素：,杂散光,从分光器得到的单色光中还有一些不在谱带范围内与所需波长相隔较远的光称为杂散光。,散射光和反射光,要求真溶液，以减少散射光和反射光。悬浊液，颗粒大的易产生散射光和反射光,非平行光,对于吸收池的光要求是平行光,若是非平行光则造成较大的偏差,.,其原因是非平行光增大了吸收池的厚度,L.,back,第三节实验技术及分析条件,一、,测定条件的选择,二、显色反应条件的选择,三,、提高光度测定灵敏度和选择性的途径,一、测定条件的选择,1.,选择适当的入射波长,一般应该选择,max,为入射光波长。,如果,max,处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。,2.,选择合适的参比溶液,为什么需要使用参比溶液？,测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。,参比溶液的选择一般遵循以下原则：, 若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收，其它所加试剂均无吸收，用纯溶剂作参比溶液（,溶剂参比,）；, 若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液本身无吸收，用不加试样溶液作参比溶液,(,试剂空白,),；, 若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则可用不加显色剂的溶液作参比,(,试样空白,),；, 若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸收，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。,3.,控制适宜的吸光度（读数范围）,设,T,=1%,，,则可绘出溶液浓度相对误差,c,/,c,与其透光度,T,的关系曲线（如图），当,T,=1%,，,T,在,20%,65%,之间时，浓度相对误差较小，最佳读数范围。,可求出浓度相对误差最小时的透光度,T,min,为：,T,min,36.8%,A,min,0.434,用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在,T,%=20,65% (,吸光度,A,=0.70,0.20),。,二、,显色反应的选择,1.,选择显色反应时应考虑的因素,灵敏度高、选择性高、生成物稳定、,显色剂在测定波长处无明显吸收,，两种有色物最大吸收波长之差：,“,对比度,”,，要求, 60nm,。,2.,配位显色反应：配位反应、氧化还原显色反应,例如：钢中微量锰的测定，,Mn,2,不能直接进行光度测定：,2Mn,2,5S,2,O,8,2-,8 H,2,O = 2MnO,4,-,+ 10SO,4,2-,16H,+,将,Mn,2,氧化成紫红色的,MnO,4,-,后,，,在,525nm,处进行测定。,3.,常用显色剂,无机显色剂：,硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。,有机显色剂：,种类繁多,偶氮类显色剂,：,本身是有色物质，生成配合物后，颜色发生明显变化；具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂,、,PAR等,。,三苯甲烷类,：,铬天青S、二甲酚橙等,4,、显色反应条件的选择,（,1,）显色剂用量,吸光度,A,与显色剂用量,C,R,的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。,（,2,）反应体系的酸度,在相同实验条件下，分别测定不同,pH,值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的,pH,范围。,（,3,）显色时间与温度：,实验确定,（,4,）溶剂：,一般尽量采用水相测定，,5,、共存离子干扰的消除,（,1,）加入掩蔽剂,选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。 例：测定,Ti,4,，,可加入,H,3,PO,4,掩蔽剂使,Fe,3+,(,黄色,),成为,Fe(PO,),2,3-,(,无色,),，消除,Fe,3+,的干扰；又如用铬天菁,S,光度法测定,Al,3+,时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将,Fe,3+,还原为,Fe,2+,，,消除,Fe,3+,的干扰。,（,2,）选择适当的显色反应条件,（,3,）分离干扰离子,三、提高光度测定灵敏度和选择性的途径,1.,合成新的高灵敏度有机显色剂,2.,采用分离富集和测定相结合,3.,采用三元,(,多元,),配合物显色体系,由一个中心金属离子与两种,(,或两种以上,),不同配位体形成的配合物，称为三元,(,多元,),配合物。,多元配合物显色反应具有很高的灵敏度，一方面是因为多元配合物比其相应的二元配合物分子截面积更大；另一方面是因为第二或第三配位体的引入，可能产生配位体之间、配位体与中心金属离子间的协同作用，使共轭,电子的流动性和电子跃迁几率增大。,三元配合物主要类型有：三元离子缔合物、三元混配配合物、三元胶束,(,增溶,),配合物。,第四节紫外分光光度计,一、,UV-,vis,计,结构与原理,1,、主要部件,2,、,紫外,-,可见分光光度计类型,(1),单光束分光光度计,(2),双光束分光光度计,(3),双波长分光光度计,(4),双重单色器分光光度计,光源,单色器,样品室,检测器,显示器,二、分光光度计的类型,types of spectrometer,1.,单光束,简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。,2.,双光束,自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。,3.,双波长,将不同波长的两束单色光,(,1,、,2,),快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。,=,1,2nm,。,(2),单色器与,色散元件,组成,:,进口狭缝 准直镜 色散元件出口狭缝,色散元件,：,将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；,准直镜,：聚光镜,狭缝,：宽度为,0,2mm,or 3mm,，可调节,Back,单色器,是,将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的,光学系统,。,棱镜：玻璃、石英,光栅：高度抛光的表面上刻出大量平行等距离槽。,600 - 1200,条槽,/1mm,。,(,),吸收池与检测器,吸收池,（比色皿）光学玻璃用于可见光，石英用于紫外光，厚度：,0.5cm,、,1cm,、,2cm,（,4,） 结果显示记录系统,检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理,检测器,光信号,-,可测的电信号,常用的有光电池、光电管或光电倍增管。,Back,(1),光 源,对光源的要求,发射强度足够而且稳定, 具有连续光谱且发光面积小,可见光区：,钨灯,或卤钨灯 波长,320-3200nm,紫外区,:,氢灯或,氘灯,波长,150-400nm,back,5,、目前紫外可见光分光光度计,UV8500,双光束紫外可见光分光光度计,生产厂家：上海天美科学仪器有限公司,Lambda7,紫外可见光分光光度计,生产厂家：美国,Perkin-Elmer,功能：双光束、导数光谱,75,型,Back,72,型,Back,第六节 定量分析,定量分析的概述,一、目视比色法：,二、光电比色法：,三、分光光度法：, 单一组分定量分析, 混合物的定量分析,单一组份的内容,单一组份测量步骤,吸收系数法,对照法,标准曲线法,1,、解线性方程,组,2,、双波长等吸收消去法,3,、系数倍率法,定量分析的概述,波长范围,目视比色法、光电比色法及可见分光光度法测定的波长范围为,400-760nm,。紫外分光光度法测定的波长范围为,200-400nm,。,测定对象,可见分光光度法测定的对象是有色溶液或能与显色剂作用而显色的溶液。紫外分光光度法测定对象是含双键或,-,共轭的有机化合物。,Back,单一组份的内容,单一分组包括两方面内容：,其一：指试样中只含有一种组分,其二：混合物中待测组分的最大吸收峰并不位于其它共存物质的吸收波长处,.,单一组份测量步骤,配制一系列标准浓度的标准液,测定物质的吸收光谱，选择最大吸收峰波长,max,若一个物质有几个吸收峰，如何选择？,a:,选择吸收峰较高（,A,值较大）,b:,吸收峰处吸收度随波长变化较小,c:,并且其他物质没有吸收的波长,在选择的波长下进行定量分析,其方法有：吸光系数法、对照法、标准曲线法,吸光系数法,根据,A=ELC,只要已知,或,E,1cm,1%,值，根据被测得吸光度，可求出被测物的浓度。,E,值：从手册或文献中查处,例,维生素,B,12,样品,25.0mg,用,H,2,O,溶成,1000ml,后，盛于,1cm,吸收池中，在,361nm,处测得吸收度为,0.507 (,已知,E,1cm,1%,= 207),对照法,同一物质，同台仪器 ，同一波长测定，故,L,、,E,相等,A,标,/ A,样,= C,标,/ C,样,C,样,= C,标,A,样,/ A,标,在同样条件下配制标准溶液和样品溶液，在选定波长处分别测量吸光度。,A,标,= EC,标,L,A,样,= EC,样,L,缺点：易造成偶然误差，从统计学观点看误差很大。,标准曲线法,1.,方法,2.,标准曲线法优缺点,:,3.,回归直线方程,吸收池厚度不变,(,同吸收池,),入射光波长不变,其它条件不变情况下：,在一定浓度范围内,配制一系列浓度标准溶液,分别测定不同浓度下的吸光度,A,作图,A-C,对待测样品测出,A,查出,C,值,.,2.,标准曲线法优缺点,优点,:,克服了吸光系数法、对照法的不足,缺点,:,尽管配制一系列标准液作图，有时还会有明显偏差；作图有人为因素引起误差。,如果要求精确测定时，可用回归直线方程计算样品浓度。,back,混合物的定量分析,考虑最简单的,a,、,b,两组分混合的定量分析：,对于图形,1,混合物有,A,、,B,两种组分，在,a,的吸收峰,1,处，,b,没有吸收；在,b,的吸收峰,2,处，,a,无吸收。,测定方法,可分别在,1,、,2,处，用单一组分方法进行定量分析,对于图形,2, 在,1,处（即用波长,1,单色光）测,a,物质的吸光度, 用标准浓度,a,，求,E,a,的值, 用标准浓度,b,，求,E,b,的值, 在波长,2,，求,A,a+b,A,a+b,=,A,a,+,A,b,=,E,a,LC,a,+,E,b,LC,b,C,b,=,（,A,a+b,E,a,LC,a,）,/,E,b,L,对于图形,3,即,1,处，为,a,物质最大吸收，,b,也有吸收,2,处，为,b,物质最大吸收，,a,也有吸收,解线性方程组法：,等吸收双波长消去法：,双波长测定法, 根据标准浓度,a,或，测绘出他们吸收光谱图, 根据干扰组分，找出测量波长,要求：,1,。,A,b,= A,b,1, A,b,2,=0,2,。待测组分在两波长处吸收度差值,A,足够大,分别测量,A,2,和,A,1,A,2,= A,a,2,+ A,b,2,（,1,）,A,1,= A,a,1,+ A,b,1,（,2,）,A = A,2, A,1,= A,a,2,+ A,b,2, A,a,1, A,b,1,= A,a,2, A,a,1,=,（,E,a,2, E,a,1,）,C,a,L, A C,a,成线性关系，按单组成计算,例,1,：,精密称取,V,B12,对照品,20.0 mg,，加水准确稀释至,1000 mL,，将此溶液置厚度为,1 cm,的吸收池中，在,361 nm,处测得,A,0.414,。另取两个试样，一为,V,B12,的原料药，精密称取,20.0 mg,，加水准确稀释至,1000 mL,，同样条件下测得,A,0.390,，另一为,V,B12,注射液，精密吸取,1.00 mL,，稀释至,10.00 mL,，同样条件下测得,A,0.510,。试分别计算,V,B12,原料药的百分质量分,数和注射液的浓度。,例,2,：,今有,A,、,B,两种药物组成的复方制剂溶液。在,1 cm,吸收池中，分别以,295 nm,和,370 nm,的波长进行吸光度测定，测得吸光度分别为,0.320,和,0.430,。浓度为,0.01 mol/L,的,A,对照品溶液，在,1 cm,的吸收池中，波长为,295 nm,和,370 nm,处，测得吸收度分别为,0.08,和,0.90,；同样条件，浓度为,0.01 mol/L,的,B,对照品溶液测得吸收度分别为,0.67,和,0.12,。计算复方制剂中,A,和,B,的浓度（假设复方制剂其他试剂不干扰测定）。,例,3,：,有一个两色酸碱指示剂，其酸式（,HA,）吸收,420 nm,的光，摩尔吸光系数为,325 L/mol,cm,。其碱式（,A,）吸收,600 nm,的光，摩尔吸光系数为,120 L/mol,cm,。,HA,在,600 nm,处无吸收，,A,在,420 nm,处无吸收。现有该指示剂的水溶液，用,1 cm,比色皿，在,420 nm,处测得吸光度为,0.108,，在,600 nm,处吸光度为,0.280,。若指示剂的,p,K,a,为,3.90,，计算该水溶液的,pH,值。,例,4,：,某弱酸,HA,总浓度为,2.0,10,-4,mol/L,。于,520,nm,处，用,1 cm,比色皿测定，在不同,pH,值的缓冲溶液中，测得吸光度值如下：,pH,0.88,1.17,2.99,3.41,3.95,4.89,5.50,A,0.890,0.890,0.692,0.552,0.385,0.260,0.260,求：（,1,）在,520 nm,处，,HA,和,A,的,HA,A,-,；,（,2,）,HA,的电离常数,K,a,。,例,5,：,络合物,NiB,2,2,在,395nm,下有最大吸收（此条件时，,Ni,及,B,无吸收），当络合剂浓度比,Ni,2+,过量,5,倍时，,Ni,2+,完全形成络合物。根据下列数据，求,Ni,2+,+2B,NiB,2,2,的稳定常数,K,。,溶液组成及浓度,(mol/L),吸光度,(=395nm),Ni,2+,(2.5010,-4,) , B(2.2010,-1,),0.765,Ni,2+,(2.5010,-4,) , B(1.0010,-3,),0.360,