真核生物转录后的加工课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四节 真核生物转录后的加工,（Pre-RNA processing in Eukaryotes）,多数转录的,初始产物,无生物活性,，在生物体内进行,加工,处理后才具有生物活性。,转录后加工,（ post-transcriptional processing）:,是指将各种,前体RNA,（Pre-RNA）分子加工转变成,有功能的,、,成熟的,各种RNA,(mRNA，rRNA或tRNA等) 的,过程,。,Pre-RNA,Mature RNA,加帽（Capping）,加尾（Tailing）,剪接（Splicing ）,碱基修饰,（,B,ases modification,）,编辑（Editing,）,转录后加工的主要方式:,RNA加工修饰主要对象:,hnRNA,：,mRNA,前体,pre-rRNA,：,rRNA,前体,pre-tRNA,：,tRNA,前体,一、tRNA 前体的加工,（一）真核生物tRNA基因结构,真核,tRNA,的基因,成簇,排列，基因间,有间隔区,，是一种,重复序列,；,前体分子,tRNA,是,单顺反子,;,前体分子,tRNA,中含有,内含子,；,前体分子,tRNA,中,没有,3,-CCA,序列。,（二）tRNA前体的加工,剪接内含子；,柄部结构的加工：加上,CCA-OH,的,3,末端，完成柄部结构；,碱基修饰。,（三）tRNA前体的加工过程,1、内含子剪接,位置相同,，都在反密码子环的下游；, 不同tRNA的内含子,长度和序列各异,；, 外显子和内含子,交界处无保守序列,，内含子的剪切是依靠RNase异体催化，进行剪接；,内含子和反密码子配对形成,茎环结构,，保护了反密码子，使其免受酶的降解。,tRNA内含子特点：,酵母tRNA,Phe,内含子的结构（引自B. Lewn, 2000）,剪接过程：,第一步：,核酸酶切割,释放一条线状内含子,和两个“tRNA半分子”,第二步：,RNA连接酶连接断端,切除tRNA内含子的核酸酶很,特殊,，产生,2,-3环磷酸,和,5-OH,，因此不能直接连接。,3端,需通过,环磷酸二酯酶,（Phosphodiesterase）将2-3环磷酸打开，形成,3-OH,。,5,端需在,激酶,作用下将,5-OH磷酸化,。再通过连接酶将两个半分子连接起来。哺乳动物的tRNA连接酶可将2-3环磷酸与5-OH直接连接起来。,剪接特点：,(1)真核tRNA内含子的精确剪切不依赖内含子的一级序列和大小，,剪切反应的识别信号,是 “三叶草” 的,二级结构,；,(2),不是转酯反应,；,(3),RNase异体催化,剪切内含子。,2、柄部结构加工,- 加上CCA-OH的3末端,tRNA核苷转移酶,tRNA nucleotidyl,transferase,3、碱基修饰,（1）,（1）,（3）,（2）,（4）,（2）,还原反应,如：U, DHU,（3）,核苷内的转位反应,如：U, ,（4）,脱氨反应,如：A,I,如：A, A,m,（1）,甲基化,D臂,反密码子臂,额外臂,T,C臂,受体臂,补充：,原核生物tRNA 前体的加工,（一）原核生物tRNA基因结构,原核的tRNA初始转录本,多为多顺反子,（polycistron），少数的tRNA前体为,单顺反子,（monocistron）。基因结构具体有三种不同的情况：,1、几个tRNA分子串连在一起串联的；,串联的tRNA分子都是相同的；,串联的tRNA分子是不同的；,2、由tRNA和rRNA串联组成；,3、tRNA前体为单顺反子,原核生物中三种tRNA前体分子,（二）原核生物tRNA前体的加工,tRNA的加工分成,3个阶段,：,（1）“,斩头,”，形成5末端。,RNaseP,是由蛋白和RNA组成的复合体，分子量为130kDa，其RNA长375nt。RNaseP具有,内切酶的活性,，可切除前体tRNA 5端的,前导序列,，此酶不识别特殊的序列，而,识别二级结构,发夹所组成的tRNA。,（2）“,去尾,”，形成3-OH末端。,此过程由内切酶,RNaseF,和外切酶的共同参与。前者识别发夹结构，后者识别CCA序列。对于具有CCA末端的1型tRNA前体修整3端的外切酶是,RNaseD,，在CCA末端它一次切除（或逐步切除）3的碱基。对于没有CCA序列的2型tRNA前体分子来说，还不清楚是通过何种RNase外切酶来切。但是，当前体切除3端附加序列后，必须外加CCA。,“斩头”,“去尾”,RNaseF,RNaseF,（3）,修饰,：在前体tRNA的一些专一部位的碱基需要通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等的作用进行修饰成为特殊的碱基，如氨基酸臂上5的4-硫尿苷（4tu），D臂上的2甲基鸟苷（2mG），TC臂上的假尿苷（）以及反密码子环上的2异戊腺苷（2ipA）,tRNA前体分子的加工,a、切除tRNA前体两端多余的序列：,5端切除几到10个核苷酸。,b、末端添加：3-端添加CCA序列。,c、修饰：形成稀,有碱基如DH,2 。,RNAaseP,RNAaseF,RNAaseP,RNAaseF,RNAaseD,RNAase？,ACC,表示核酸内切酶的作用,表示核苷酸转移酶的作用,表示核酸外切酶的作用,表示异构化酶的作用,-CCA,二、rRNA 前体的加工,（一）真核生物rRNA基因结构,真核生物的,18S,、,5.8S,和,28S rRNA,基因串联在一起形成一个转录本，彼此被间隔区分开,;,不同生物的,rRNA,前体大小不同：,哺乳动物为,45S,；果蝇,38S,；酵母,37S,；四膜虫,35S,每个重复单位之间的间隔,DNA,序列不转录，称为,非转录间隔序列,。,在转录时或转录后，甲基化酶立即结合到转录本上。,真核生物,5S rRNA,基因也是成簇排列的，中间隔以不被转录的区域。由,RNApol ,转录，转录后只需要进行简单的加工，或者根本不需要进行加工,。,高等真核生物核基因组前体,rRNA,中一般,没有内含子,。,18S RNA 结合39个甲基化酶,28S RNA 结合74个甲基化酶,推测：,甲基化用于标明转录本的加工区域;,（二）rRNA前体的加工过程, 切除5端的前导序列，45S初始转录本变成41S中间产物；,从41S的中间产物中先切下18S的片段，产物分别为20S（含18S rRNA片段）和32S；,32S中间产物（含5.8S和28S rRNA）中的5.8S和28S之间进行部分退火，形成发夹结构；,通过外切酶等将20S中残余的ITS切除；将已退火的32S中的ITS切除掉。,已知整个加工过程是在核糖体上进行的，而不是以游离的rRNA进行加工的。,补充：,原核生物rRNA 前体的加工,（一）原核生物rRNA基因结构,rRNA序列是保守的,每个转录单位都含有16S、23S、5S RNA，有时会有一个或几个tRNA。但,tRNA的数量，种类及位置都不固定,，或在16S RNA和23rRNA之间的间隔序列中，或在3端5S rRNA之后。,16S、23S、5S RNA仅存在于核糖体中且是等比例的。每个转录单位中它们也是等比例的，因此串联转录单位保障了它们的等量关系。,16S,tRNA,23S,5S,tRNA,（二）原核生物rRNA前体的加工,rRNA前体的加工主要是由,内切酶RNase ,负责。,首先,，P16S和P23S各自的5和3都能互补（茎环），RNase 在茎上交错切割产生了P16S，P23S和P5S rRNA前体；,然后,，由,外切酶,进行修正，切除多余的部分，形成成熟的rRNA分子。,三、mRNA 前体的加工,1、 5,端形成,帽子结构（,m7,GpppNp ）,2、3,端加上,多聚腺苷酸尾巴（poly A tail）,3、中部剪接,除去内含子,4、链内部核苷酸的,甲基化,hnRNA转变成mRNA的加工过程包括：,（一）5-端加上帽子结构（mGpppNp）,1、 帽子的种类,帽子0（Cap-0）,m,7,Gppp,Xp,Yp,m,7,G 7-甲基鸟苷三磷酸,帽子1 （Cap-1）,m,7,Gppp,X,mp,Yp,第一个核苷酸的 2-O 位上产生甲基化,（,A,N,6,位甲基化）,帽子2（Cap-2）,m7Gppp,X,mpYmp,第二个核苷酸的 2-O 位上产生甲基化,（,A、G、C、U,）,单细胞真核生物只有 Cap-0,Cap-1 是其余真核生物的主要帽子形式,Cap-2 存在于某些真核生物中,2、 帽子结构的生物学功能, 使mRNA,免受核酸酶的降解,，增加mRNA的稳定性；, 有助于mRNA,越过核膜,，进入细胞质；,被蛋白质起始因子,识别,，使mRNA能与核糖体小亚基结合并开始合成蛋白质。,（二）3-端加上多聚腺苷酸尾巴（polyA）,几乎所有真核生物成熟的,mRNA,末端都有一串约,250,个腺嘌呤核苷酸尾巴。它们并非模板,DNA,编码，而是在转录完成时由,poly (A),多聚酶合成。,加尾位置,不在转录物的最末端，而是在接近末端的内部位点。在切除,mRNA 3,末端的一段序列后，再加上多聚腺苷酸。,加尾是在核内完成，先于,mRNA,中段的剪接，和转录终止同时进行。,新合成的,mRNA,的,3,-,端含两个明显的,加尾信号,。,第一个加尾信号,位于,poly (A),上游，一致顺序为,5,AAUAAA,3,；,第二个加尾信号,位于,5,AAUAAA,3,顺序下游约,15-24 nt,位置处，有一段富,GU,序列，紧随其后通常有一串富,U,的顺序。,5-,AAUAAA,-1524 bp-,GUGUGUU,GGAA,UUUUUU,GUGU-3,如果改变,5,AAUAAA,3,位置，加尾位点改变；缺失，则不发生加尾。,富,GU,序列和紧随其后的富,U,序列对正常的加尾不可缺一。,1、 ploy（A）加尾信号,2、poly（A）的生物学功能, 提高mRNA在细胞质中的,稳定性,。, 协助mRNA从细胞核向细胞质,转运,。,作为核糖体的,识别信号,，使mRNA分子有效翻译。, 对基因的,表达调控,有重要作用。,（三）mRNA的内部甲基化,真核生物,mRNA,分子中有许多甲基化的碱基；,具体的甲基化位点还不太清楚；,主要是：,N6-,甲基腺嘌呤（,m,6,A,）；,推测可能为,mRNA,的剪切提供信号。,（四）核mRNA前体的剪接（Splicing）,真核不连续基因的初级转录产物中，外显子与内含子交替出现,-,割裂基因（,Split gene,）,；,转录后把内含子切除而把外显子连接起来产生成熟,RNA,分子的过程，叫,RNA,剪接（,RNA splicing,）,。,内含子在真核基因中所占的,比例很高,，甚至超过,99%,。,1、核mRNA内含子剪接位点特征,内含子总是由,GU,开始，以,AG,结束，其规律称为,GU-AG,法则,（,GU-AG rule),或,Chambon,法则,。,5,端剪接位点,(,供位,),相邻的保守序列：,5,-AG,GU,PuAGU-3,3,端剪接位点,(,纳位,),相邻的保守序列：,5,-(Py),n,NC,AG,-3,分枝点保守序列：,Py,80,NPy,87,Pu,75,A,Py,95,，其中,A,为百分之百保守，且,具有,2-OH,。,mRNA前体正确剪接所必需的,2、参与核hnRNA剪接的主要物质,snRNA,(small nuclear RNAs,，核内小分子,RNA,）,snRNP,SnRNA,一般,300,碱基，包括,U1-U6,等；,在自然状态下，,snRNAs,与,相关的蛋白质,形成复合,物,-,SnRNP,在剪接过程中有,5,种,snRNAs,参加，它们是,U1,、,U2,、,U4,、,U5,、和,U6,；,snRNP,、,hnRNA,、其他相关蛋白质和,剪接因子,（,S,plicing,F,actor,SF,），形成呈椭球体的复合物,-,剪接体（,Spliceosome,）,；,hnRNA,剪接通过剪接体完成,各种SnRNA功能表,U1 snRNA自我配对形成了多个茎环结构，从而构成了不同的功能区。Sm结合位点是和其他snRNP相互作用的区域。,其5端有一保守序列：3-CAUUCAU-5。 这一序列可与内含子5端的边界序列互补结合。,U2与分枝点配对,U6与mRNA 5端配对,U6 snRNA既能与U4配对也能与U2配对,3、剪接机制（简化）,第一次,转酯,左外显子、内含子剪切套索,第二次,转酯,外显子连接、套索状内含子释放,剪接体解体与套索降解同步,4、具体的剪接机制,U1与U2作用使内含子的 5端和 3端带到一起,U1通过与 5剪接点互补而结合,U2识别并结合分支点A,U1、U2、mRNA与 U4U5U6复合物形成一个完整的剪接体,U1、U4脱离，形成活性剪接体，通过两次转酯反应完成内含子剪切,U1通过与 5剪接点互补而结合,U2AF与 3剪接点内含子结合,U2识别并结合分支点A ，并在SF1和BBP帮助下使内含子的 5端和 3端带到一起,U4/U5/U6复合物与U1/U2结合,4、具体的剪接机制,U1脱离,U4脱离，U6与U2间发生第一次转酯反应，套索结构形成,第二次转酯反应，U2/U5/U6与套索结构结合,成熟的mRNA释放,续上页,四、其他的内含子剪接方式,1、内含子的分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为,四类,。,I类：,线粒体、叶绿体及低等真核生物细胞核的rRNA基因；,II类：,线粒体、叶绿体的mRNA基因；,III类：,大多数真核生物,核mRNA,的基因；,tRNA内含子：,tRNA,基因。,2、剪接方式,方式一：,由剪接装置完成,（核mRNA内含子）,可供识别的特异序列（GU-AG）,剪接装置由多种蛋白质和核蛋白组成-,剪接体,；,方式二：,自我剪接,（两类内含子 、 ）,形成特定的二级结构,，,具有催化剪接能力的RNA ；,方式三：,需要蛋白质酶参与的剪接,（酵母tRNA）,前两种剪接都属于转酯反应,3、核酶（,Ribozyme,）,概念：,Ribozymes are specialized ribonucleic acid (RNA) molecules with enzyme-like properties.,指具有催化活性的RNA。, 一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是RNA或带有蛋白的RNA；,酶仅催化反应，反应前后其本身的质和量都不发生改变；而核酶,既是催化剂又是底物,，随着反应的进行，本身也消失了。,核酶与酶的区别：,核酶发现的历史：,In,1967,Carl Woese,Francis Crick, and,Leslie Orgel,were the first to suggest that RNA could act as a catalyst based upon findings that it can form complex,secondary structures,.,The first ribozyme was discovered in the,1982,by,Thomas R. Cech,and his coworkers who were studying RNA,splicing,in,Tetrahymena thermophila,.,在四膜虫（,Tetrahymena thermophila,）中，26S rRNA分子含有1个0.4 Kb的内含子。,17S,5.8S,26S,ETS1,ITS1,ITS2,ETS2,17S,5.8S,26S,IVS,1982年，Thomas Cech及其同事发现，一个仅含有纯化的6.4 Kb前体、ATP及GTP而没有酶蛋白的,对照实验样品,中发生了剪接作用。进一步实验证实，在核苷酸存在的条件下，RNA发生了自我剪接（self-splicing）。,实验结果表明,：RNA分子也具有高度特异的催化活性。,Kelly Kruger, Paula J. Grabowski, Arthur J. Zaug, Julie Sands, Daniel Gottschling and Thomas R. Cech.,1982,.,Self-splicing RNA: autoexcision and autocylcization of the ribosomal RNA intervening sequence of Tetrahymena.,Cell 31:147-157,核酶的分类,根据催化反应的类型，可分为2大类：,剪切型核酶,剪接型核酶,I内含子,II内含子,锤头型核酶,（Hammerhead）,发夹型核酶,(Hairpin),丁型肝炎病毒（HDV)核酶,RNase P,自身催化型,异体催化型,3种剪切型核酶的二级结构,Elizabeth A. Doherty and Jennifer A. Doudna. RIBOZYME STRUCTURES AND MECHANISMS,.,Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct,.,2001,30:45775,.,锤头型,发夹型,HDV,4、I类含子的剪接,结构特点：,（1）5剪接点和3剪接点-U G ,（2）有由保守序列形成的二级结构,a、保守序列为 5PQRS3,P与Q互补、R与S互补而形成中部,核心结构,b、 二级结构中还包括内含子与外显子的某一序列,互补所形成的二级结构。,内部引导序列（interal guide sequence，IGS）。,I类含子的二级结构,四膜虫rRNA内含子的二级结构,5,-端核苷酸序列,I类内含子的自我剪接过程,3、,II类含子的剪接,结构特点：,（1）剪接点序列为5GUGCG- - -YnAG，符合GU-AG法则,（2）分枝点保守序列：,-Py Pu Py Py U,A,Py-,。,其中A为百分之百保守，且具有2-OH。,（3）二级结构,形成6个茎环结构，使两个并列的功能区靠近。,形成6个茎环结构，使两个并列的功能区靠近。功能区5和功能区6被两个碱基隔开。功能区6含有1个不配对A残基，其上带有2-OH，发动第一次转酯反应。,类内含子的二级结构,II类内含子的自我剪接过程,与前所叙的核基因mRNA的剪接过程相比，,和类内含子剪接的最大特点是不需要其他成分的参与,，RNA分子本身能形成剪接所需的空间结构和催化活性区域。在,核基因mRNA的剪接过程中，需要多种成分特别是snRNA与RNA前体共同作用,才能形成剪接所需的空间结构，产生具催化功能的区域。,几种不同内含子剪接反应的区别,五、 RNA的编辑和再编码,指,转录后的RNA,在,编码区,发生,碱基的替换,、,插入,或,丢失,等现象。,（一）RNA的编辑（RNA editing）,碱基的替换,-哺乳动物载脂蛋白基因转录产物的编辑,指导RNA指导的编辑,-利什曼原虫属细胞色素b mRNA的编辑,例子：,尿苷酸的缺失和添加,-,锥虫线粒体mRNA转录后编辑,概念：,1、碱基的替换,表明：,RNA编辑可能是充分发挥生理功能所必须的。,2、尿苷酸的缺失和添加,1986年，R. Benne在研究,锥虫,线粒体mRNA转录加工时发现mRNA的多个编码位置上,加入或丢失尿苷酸,；1990年在高等动物和病毒中也发现了编辑现象。,3、指导RNA指导的编辑,研究发现，利什曼原虫属细胞色素,b mRNA,中含有许多,独立于核基因的尿嘧啶残基,。,指导,RNA,与被编辑区及其周围部分核酸序列虽然有相当程度的,互补性,，但该,RNA,上,存在一些未能配对的腺嘌呤,，形成,缺口,，为插入尿嘧啶提供了模板。,特异性插入这些残基的信息来自,指导,RNA,（,guide RNA,）,。,反应完成后，,指导,RNA,从,mRNA,上,解离,下来，而,mRNA,则被用做翻译的模板,。,指导RNA指导的编辑机制,4、RNA编辑的生物学意义,校正作用：有些基因丢失的遗传信息可以通过,RNA,编辑得到恢复；,调控翻译：通过编辑可以构建或去除起始密码子和终止密码子，是基因表达调控的一种手段；,扩充遗传信息：能使基因产物获得新的结构 和功能，有利于生物进化。,（p101）,（二）RNA的再编码（RNA recoding）,概念：,mRNA在某些情况下不是以固定的方式翻译，而可以改变原来的编码信息，以不同的方式进行编码，科学上把,RNA编码,和,读码,方式的,改变,称为,RNA的再编码,。,例子：,核糖体程序性+1/-1移位,：mRNA读码信号发上+1/-1移位；,核糖体跳跃,：核糖体跳过多个核苷酸；,终止子通读,：硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸,意义：,可使一种mRNA产生两种或多种相互关联但又不同的蛋白质，可能是蛋白质合成的一种调节机制。,第五节 原、真核生物,mRNA,的特征比较,原、真核生物mRNA转录后加工,原、真核生物mRNA结构特征比较,1、原核生物mRNA的特征,半衰期短,多以多顺反子的形式存在,5,端无“帽子”结构,2、真核生物mRNA的特征,5,端存在“帽子”结构,3,端没有或只有较短的,poly,（,A,）尾巴,多数,mRNA 3,端具有,poly,（,A,）尾巴,以单顺反子的形式存在,第六节,RNA合成与DNA合成异同点,相同点：,1、都以DNA链作为模板,2、合成的方向均为53,3、聚合反应均是通过核苷酸之间形成的3,5 -磷酸二酯键，使核苷酸链延长。,不同点：,复制,转录,模板,两条链均复制,模板链转录,（不对称转录）,原料,dNTP,NTP,酶,DNA聚合酶,RNA聚合酶,产物,子代双链DNA,（半保留复制）,mRNA， tRNA， rRNA,配对,A-T；G-C,A-U；G-C,引物,RNA引物,无,本章结束,谢谢！,