荧光实时定量CR

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,荧光实时定量,PCR,1,基本概念,化学光学原理,基因表达定量,4,1,2,3,等位基因鉴定原理,5,数学原理,2,基本概念,1,3,PCR,4,链式反应的雪崩效应,5,典型,PCR,的四个阶段,Base,6,实时荧光定量,PCR,PCR,扩增反应中，引入一种荧光化学物质，,对每一个循环产物荧光信号的实时检测,可以得到荧光扩增曲线,实现对,起始模板定量和定性,分析,7,荧光,物质,激发光,发射光 滤光片 检测（观察）,8,两种定量化学,9,染料染色,SYBR Green I,是一种,DNA,小沟结合染料,与,DNA,双链结合时发光,游离时不发光,10,PCR,过程中染料的掺入：信号强度与双链,DNA,分子数正比,11,PCR,过程结束，可控制温度缓慢升高,(ie. 60,o,c to 95,o,c, 0.2,o,c/sec),dsDNA,解链成为,ssDNA,SYBR Green I,被释放，荧光信号消失,Tm,值：,50%DNA,变成单链时的温度，此温度与双链,DNA,的长度、,GC,含量有关，可部分代表序列的特异性,熔解曲线,原始图谱,12,熔解曲线,将温度与荧光强度的变化求导,(-dI/dT),原始图谱,对数图谱,13,融解曲线分析，单一峰,无非特异性荧光,定量准确,融解曲线分析，出现杂峰,其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确,熔解曲线,14,染料的特点,15,探针标记,Taqman,探针,一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增有关。,探针,5,端连接荧光基团，,3,端连接淬灭基团。,利用了,PCR,延伸反应时，聚合酶的,5,外切酶活性，,使荧光基团和淬灭基团分离。,16,信号强度与结合探针的,DNA,分子数成正比,17,荧光共振能量转移,(FRET),Oligo 1: Fluorescein,Oligo 2: LC Red 640,Excitation,Emission,Transfer,10nm,18,Tagman-MGB,探针： 分辨,1,个碱基的差别,提高信噪比,提高,Tm,值,19,分子信标,TaqMan,探针的衍生,发夹型杂交探针,形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针,发夹结构的两端分别连接荧光基团和淬灭基团。,利用分子构象的改变使得荧光基团和淬灭基团分开,。,20,探针的特点,21,方法,优点,缺点,适用范围,SYBR Green I,方法,适用性广,灵敏,方便,便宜,引物要求高,易出现非特异性带,不能进行多重定量,适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究,TaqMan,方法,特异性高,重复性好,多重定量,价格高,只适合特定目标,病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核,遗传疾病的诊断,不同定量方法的比较,22,3,数学原理,23,横坐标：,扩增循环数（,Cycle,）,纵坐标：,荧光强度,每个循环延伸步骤进行一次荧光信号的收集,扩增曲线图,24,理想的,PCR,反应：,X=X,0,*2,n,非理想的,PCR,反应：,X=X,0,(1+Ex),n,n,：扩增反应的循环次数,X,：第,n,次循环后的产物量,X,0,：初始模板量,Ex,：扩增效率,在扩增产物达到定值,M,时,:,X,C,=X,0,(1+Ex),C,=M,log M=log X,0,(1+Ex),C,整理得,:,log X,0,= - log(1+,Ex,) *,C,+ log M,C,：,产物到,M,值的循环数,25,log X,0,= - log(1+,Ex,) *,C,+ log M,M:,阈值,C-Ct,：产物到阈值的循环数,Log X,0,（初始模板量）与,Ct,线性关系,:,Ex,相对恒定,26,相同模板进行,96,次扩增，终点处产物量不恒定，,对数期,Ct,值则极具重现性,27,结论,在荧光信号的,对数生长期,一定阈值下的循环数即,Ct,值与样品起始浓度成线性相关,不同样品间扩增效率的相对差异小,同一样品不同次的扩增效率的相对差异小,28,基因表达定量,4,29,2,种定量目标,30,检测起始模板数的精确拷贝数,标准曲线法,病毒感染的定量监测,HIV RNA,，,HCV RNA,不同处理的样本之间基因的表达差异,2,- Ct,、,Pfaffl,等, 双标准曲线法,药物处理对目的基因表达的影响,病人和正常人目的基因的差异,绝对定量,相对定量,31,绝对定量的标准品,标准样品的种类：,含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒,含有和待测样品相同扩增片段的,cDNA,纯化的待测样品扩增,PCR,的产物,紫外分光光度计或荧光酶标测定标准样品的浓度，,根据质粒或,cDNA,分子量换算成拷贝数，做系列稀释。,32,绝对定量,标准曲线,LogX,0,与,Ct,呈线性关系，,通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，,根据样品,Ct,值，就可以计算出样品中所含的模板量,33,相对定量,Sample B,Sample A,目的基因扩增效率相同,RNA,提取效率相同,细胞起始数相同,34,相对定量内参,稳定表达于不同类型的细胞和组织,而且其表达量是近似的,无显著性差别,;,其稳定的表达水平与目标基因相似,;,不受任何内源性或外源性因素的影响,如不受任何实验处理措施的影响,GAPDH,，,b-Actin,，,18S,35,相对定量,对目的基因和内参基因同时做,PCR,待测样品目的基因的浓度,待测样品内参基因的浓度,.,对照样品目的基因的浓度,对照样品内参基因的浓度,目的基因处理前后变化,=,36,双标准曲线法,对目的基因和内参基因做两组标准曲线,待测样品目的基因的浓度,待测样品内参基因的浓度,.,对照样品目的基因的浓度,对照样品内参基因的浓度,目的基因处理前后变化,=,检测样品,内参基因,H,目的基因,X,定量结果,定量结果,校正值,相对量,对照样品,6391.5,343.4,0.0537,1.000,待测样品,1,8589.7,17.3,0.0020,0.037,待测样品,2,7432.9,1946.1,0.2618,4.874,37,相对定量的算法,2,- Ct,假设,100% efficiency,一个内参基因,Pfaffl,法,扩增效率,一个内参基因,Vandesompele,法,扩增效率,多个内参基因均一化,38,2,- CT,假设目的和参照基因扩增效率都接近,100,且相对偏差不超过,5,样品,目的基因,(mean Ct),内参基因,(means Ct), Ct, Ct,2,- Ct,处理前,18,17,1,0,1,处理后,16,17.4,-1.4,-2.4,5.3,log X,0,= - log(1+,Ex,) *,C,+ log M,39,扩增效率,40,PFAFFL,法,41,等位基因鉴定原理,5,42,双探针法,43,