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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,核酸分子杂交,(nucleic acid hybridization),核酸分子杂交是目前分子生物学和生物医学领域一项,应用十分广泛的技术。根据核酸杂交探测,靶分子,的不同，,核酸杂交分为：,1,、,Southern blot,：,检测经凝胶电泳分开的,DNA,分子,需转印到膜上,2,、,Northern blot,：,检测经凝胶电泳分开的,RNA,分子，,需转印到膜上,3,、斑点杂交（,dot blot,),：,检测,未经分离的,，固定在,膜上的,DNA,或,RNA,分子,4,、 菌落或噬斑杂交,(colony/plaque blots):,指检测,固定在膜上的，经裂解后从,细菌和噬菌体中释放的,DNA,分子,5,、原位杂交（,in situ hybridization):,检测,细胞或组,织中的,DNA,或,RNA,分子。,第一节 核酸分子杂交的基本原理,核酸分子杂交是指具有互补序列的两条核酸单链在,一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。,在此过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化。,探针,（,probe),：,在杂交体系中,带有标记,的,已知,序列,的,DNA,或,RNA,片段，通常先将,待测,的,单链,靶核酸,固定在适当的载体上，然后置于含相应,单链核酸探针,的杂交反应体系中，通过碱基互补配对原则，形成双,链结构，通过对标记探针的检测，可以判定待检测样,品中相应序列的存在与否与分子量大小。,一 、,DNA,变性与复性（,denaturation,and,renaturation,),（,一）变性：在理、化因素作用下（加热、酸碱或紫外,线照射下），两条,DNA,链之间,氢键,断裂，,变成两条,单链,。,变性的,本质,：双链间,氢键,断裂。未影响,共价键,（磷,酸二酯键）。,变性常用的方法：,1,、热变性,1,）,DNA,分子中,G=C,含量越多，解链所需的温度就越高,2,）,DNA,变性后理化性质改变 黏度降低,A,260,升高 增色效应,3,）,Hyperchromic,effect: DNA,变性后，双螺旋结构,解开，碱基暴露，对紫外光吸收增加的现象。,4,）解链曲线：热变性过程中，将温度升高并以,O.D260,作图，可得一“,S”,型曲线，即解链曲线,可见,DNA,变性是在一个狭窄的温度范围内发生的突,跃过程，类似晶体的融化，所以又称融解曲线,（,melting curve),5),融解温度（,Tm,）：,DNA,变性,50%,时的温度，多数,在,85-90,度左右。,2,酸碱变性：当核酸溶液的,pH10,时，核,酸变性,分子杂交中常用碱变性（,0.5mol/L,NaOH,溶液）,3,化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等可破坏氢键,（二）复性：,DNA,的变性是可逆的，即两条互补的单链,DNA,分子在变性条件去除后如条件适宜，,DNA,可恢复其双螺旋结构。,减色效应,(,hypochromic,effect),：,伴随复性会出现,DNA,溶液紫外光吸收降低的现象。,二 影响杂交的因素,1,、核酸分子的浓度和长度,核酸浓度越大，碰撞几率越高，复性速度越快,核酸分子越长，越难形成正确配对，复性速度越慢,2,、温度,温度不宜太低（少数碱基配对形成的局部双链能解离）,温度也不宜太高（不能形成碱基配对）,所以复性的最适温度是较,Tm,低,25 ,3,、离子强度,足以消除两条链,P,的静电斥力，常用,0.15-0.5mol/LNaCl,高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以进行序列,不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交液和洗膜,液的高盐浓度。,4,、杂交液的甲酰胺：甲酰胺能破坏氢键，降低核酸杂交的,Tm,含,30%-50%,甲酰胺的杂交溶液温度能降低,30-42 ,5,、 核酸分子的复杂性：指,DNA,分子中不重复碱基的总量,核酸分子的复杂性小（重复顺序多，分子量小），复性快,6,、非特异性杂交反应：为减少非特异性杂交反应，在杂交前先,进行预杂交封闭，以减少非特异性吸附。常用鲑鱼精子,DNA,或高分子化合物,第二节 核酸分子杂交的基本方法,一,Southern,印迹杂交,Southern,印迹杂交是,E. Southern,于,1975,年创立的杂交方,法，是指,DNA,与,DNA,的杂交，属固相杂交,（一）待测核酸样品的制备,1,、制备待测,DNA,DNA,酶、蛋白酶,细胞或组织 裂解细胞,DNA,酚,/,氯仿,2,、,DNA,的限制酶消化,选择一种或两种限制酶，对,DNA,进行部分或充分消化,（二）待测,DNA,样品的电泳分离,通常用,0.8-1.0%,琼脂糖凝胶进行电泳，对,DNA,片段进行分,离。,（三）凝胶中核酸的原位变性,DNA,样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构,电泳后必须将,DNA,片段变性并转移到适当的固相支持物上，,才能进行,Southern,印迹杂交,原位变性,琼脂糖凝胶电泳后 将凝胶浸入,1.5mol/LNaCl,、,中和,0.5mol/LNaOH,中，室温,30,用,Tris,-HCL,、,Nacl,溶液中和 转膜,（四）,Southern,转膜,将凝胶中的,DNA,片段转移到固相支持物上。,常用的固相支持物：化学活化膜、硝酸纤维素膜（,NC,膜）， 尼龙膜，,Southern,转膜的方法：,1,、毛细管虹吸法：利用高盐转移缓冲液的推动作用和虹吸作用,2,、电转印法：利用电泳作用将凝胶中的,DNA,转移到膜上,适用于转移大片段,DNA,3,、,真空转移：原理同毛细管虹吸，需真空泵,(3),真空转移法：,真空转移法可在转膜的同时进行,DNA,的变性和中和，一般先用变性液转移,15,30,分钟，然后换用中和液转移,15,30,分钟，整个过程只需,30,分钟至,1,小时左右。但应注意两个问题：,真空压力不能太大，若压力过大，凝胶被压缩，转移效率会降低；,真空转移仪要密封严，防止漏气影响压力的产生。,（五）探针的制备,核素或非核素标记的探针,（六）,Southern,预杂交和杂交,预杂交的目的：将膜上所有能与,DNA,结合的位点全部封闭,预杂交液：不含探针的杂交液，其中含鲑鱼精子,DNA,（,该,DNA,与哺乳动物的,DNA,同源性低，不会与探针杂交）、聚乙,烯吡咯烷酮，牛血清白蛋白等大分子物质。,杂交：含有探针，通常在相对高离子强度的缓冲盐溶液中杂,交过夜，杂交液按,50,l/cm,2,加入,（七）洗膜,目的：洗去未结合的,、游离,的放射性探针及可能非特异性结,合的,DNA,方法：将薄膜先高盐后低盐溶液进行漂洗,（八）杂交结果的检测,放射自显影,将薄膜与,X-,光胶片接触，暴光,17,天，显影、定影，即可在,X,光片上见到清晰的黑色条带,二,Northern,印迹杂交,（一）类似于,Southern blot,的测定,RNA,分子的杂交技术称为,Northern blot,（,二）与,Southern blot,的主要区别：在,变性剂存在下,，以琼脂,糖,电泳分离,RNA,（,变性剂的作用是防止,RNA,分子形成发夹结,构，维持其单链线性状态）,（三）常用变性剂：乙二醛、甲醛、甲基氢氧化汞,（四）转膜：电泳结束后，不需要再进行变性和中和，直接转膜,三 斑点及狭缝印迹杂交,将,DNA,或,RNA,变性后,直接,点样于,NC,膜,优点：简单、快速、可在同一张膜上进行多个样品的检测,缺点：不能鉴别所检测核酸的分子量，且特异性不高,四 原位杂交（,in situ hybridization,）,核酸保持在细胞或组织中,，经适当的方法处理细胞或组织后,将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。,原位杂交不需要从组织或细胞中提取核酸，能完整的保持组,织与细胞的形态。,细胞内原位杂交,杂交反应在载玻片上进行,组织切片原位杂交,原位杂交的步骤：,1,、组织或细胞的固定,用,10%,甲醛、,4%,多聚甲醛、乙醇：冰乙酸（,3,：,1,）等将,组织或细胞固定在载玻片上,2,、杂交前的预处理,目的：降解核酸表面的蛋白，提高探针的穿透力,方法：蛋白酶、去垢剂（,Triton X-100,、,SDS,）,注意：蛋白酶不能含有核酸酶,消化时间不宜过长、否则会导致细胞结构的破坏、脱,片,3,、探针的选择,核素标记,探针：,DNA,、,RNA,、,寡核苷酸探针均可,非核素标记,4,、杂交,取,10-20,L,杂交液滴在预处理过的玻片上，盖上硅化盖玻片,排除气泡，用液体石蜡或胶泥封片，以防杂交液流失。,5,、杂交结果检测：,同位素：放射自显影,生物素或地高辛,配,基标记的探针：显色反应,五 液相杂交,液相杂交是指待测核酸分子与核酸探针都存在于杂交液中,碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子,第三节 探针的标记,一 探针的种类,（一）,cDNA,探针：经,RT-PCR,可制备大量的,cDNA,探针,cDNA,探针是目前应用最广泛的一种探针,（二）基因组,DNA,探针：此类探针来源于染色体,DNA,，,一般,是从,G-,文库中获取或利用,PCR,扩增基因组中某特定片段,（三）寡核苷酸探针：根据已知的核酸序列，人工合成一定长度的,寡核苷酸片段（,20-50,个碱基的单链）作为探针,（四）,RNA,探针：较少应用，可从细胞中直接提取,RNA,或以目的,基因为模板，转录合成出高放射性的,RNA,探针,二、 标记物,（一）核素标记物（放射性同位素）：灵敏度高，常用,32,P,35,S,3,H,125,I,14,C,（,二）非核素标记物：灵敏度低，但无放射性污染，探针标记后,可长期保存（,2,年以上），常用生物素、地高辛、辣根过氧,化物酶（,HRP,）、,荧光素（,FITC,、,罗丹明类）、化学发光剂,三、标记方法,主要介绍,DNA,探针的体外酶促标记法,（一）缺口平移法（,nick translation,）,1,、利用,DNase,在,DNA,双链上随机切割，造成单链缺口,2,、缺口处一个,5,-,末端，一个,3,-,末端，,3,-OH,可作为引物，,在,DNA,pol,的催化下，按,5,3,方向合成新的,DNA,单链,3,、,DNA,pol,的,5,3,外切酶活性在切口处将旧链,5,-,端,逐步切除，新合成链不,断,合成， 因为新合成链的底物是,带,标记的,*,dNTP,从而使原,DNA,分子,上,的部分核苷酸被标记的核,苷酸,所,取代,（二）随机引物法 （,random primer,）,随机引物是人工合成的长度为,6,个核苷酸残基的寡聚核苷酸的,混合物，对于任意一个,DNA,片段，随机引物混合物中都含有,一些核苷酸片段与之结合，起到引物的作用。以带标记的,*,dNTP,为底物，合成带有标记的探针,（三）,PCR,标记法,在,PCR,反应底物中，将一种,dNTP,换成带标记的,*,dNTP,（,四）末端标记法,只标记,DNA,的,5-,端或,3-,端，而非,DNA,全长，标记活性低,四 探针的纯化,（一）乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀,DNA,片段，而,dNTP,等小分,子物质则留在上清中，所以用无水乙醇沉淀,2-3,次即可达到,纯化的目的。,此法由于操作简便，一般常被用来纯化探针。,（二）,Sephadex,G-50,柱层析法：,利用,Sephadex,G-50,凝胶的分子筛作用，将,DNA,探针与,d NTP,等小分子物质分离。,（,大分子探针随着流动相流出，而小分子物质则滞留在凝胶层,析柱中。,Sephadex,G-50,层析柱的柱床不宜过大，以防第,一峰体积过大，影响杂交液的配制。如果体积过大，可用乙,醇沉淀法进行浓缩。,）,（三）微柱离心法,将,0.5 ml,Eppendorf,管管底刺一细孔，铺上一薄层硅化过的玻璃棉,或尼龙网。在管中装入,Sephadex,G-50,，,用,1.5 ml,Eppendorf,管作为,外套管，向管中反复添加双蒸水溶胀,Sephadex,G-50,，,直到柱床达,到离心管的,3/4,高度。再加,0.1ml,蒸馏水，按同样条件离心，至流出,液体积也在,0.1ml,。,将标记混合物,0.1ml,加至柱床上，柱床底部换一,个新的,1.5ml,Eppendoff,管作为套管接收标记好的,DNA,。,按同样速,度离心，流出液即标记好的探针，而未掺入,DNA,的,dNTP,等小分子,则保留在层析柱中。收集流出液，,-20,保存。,转,基因动物,(,transgenic animal),用,人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物,特点,分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达,基因打靶,(,gene targeting),通过,DNA,定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究该基因的功能。,基因敲除,(,gene knockout),：,定向敲除,基因敲入,(,gene,knockin,),：,定向替代,基因打靶的必备条件,胚胎干细胞,(,ES,细胞,),能在体外培养，保留发育的全能性,打靶载体,Neo,（,新霉素）阳性筛选标志,HSV-,tk,阴性筛选标志：单纯疱疹病毒,(,herpes simplex virus),胸腺嘧啶激酶,(,thymidine,kinase,),基因敲除的基本程序,打靶载体的构建,打靶载体导入,ES,细胞：重组置换,基因敲除,ES,细胞注射入胚泡,胚泡植入假孕小鼠的子宫中,嵌合体的杂交育种,基因打靶在医学中的应用,基因打靶与遗传病,基因打靶与肿瘤的研究,基因打靶与生物制药,
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