第二章细胞培养的设备和操作技术课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,章细胞培养的设备和操作技术,、实验室的设计和基本操作技术、培养基及其配制,一、 实验室的设计,细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：,实验准备（培养基配制，洗涤与灭菌）；,无菌操作；,控制培养。,从总体上来分，实验室主要分为两类：,基本实验室：,辅助实验室：,实验室设计,、基本实验室：,准备室,接种室,培养室, 作用,植物细胞和组织培养所需器具的洗涤、干燥和保存；培养基的配制、分装和灭菌；化学试剂的配制；重蒸馏水的生产等。, 设计要求,面积左右。通风透光，地面防滑，墙面防潮。,准备室, 实验台架 大、小水槽, 烘箱 冰箱, 天平系列 计, 高压消毒锅 各种玻璃器皿, 药品柜 （磁力）搅拌器, 电炉 蒸馏水器, 设 备,其中：玻璃器皿包括三角瓶、试管、培养瓶、培养皿、烧杯、量筒、移液管等,移液枪（根据条件需要）由枪和枪头组成,其他：锅、微波炉等,磁力搅拌器,电子天平,计,接种室,也叫无菌操作室,无菌操作室并非无菌，但应该保持清洁, 作用,供外植体的接种，培养物的转移和原生质体的游离培养操作之用。,无菌室, 设计要求,墙壁光滑平整，地面平坦无缝，除出入口和通气口外，应当密闭，空气不能对流，或者空气经净化后进入室内。,无菌室旁边应设有缓冲间，缓冲间内应有紫外灯，随时可进行灭菌。,无菌室内的日常灭菌：定期用甲醛和高锰酸钾混合后熏蒸，产生大量蒸汽，杀灭微生物。,使用前处理：用新洁尔灭（：）擦净，然后用紫外灯照射灭菌至少分钟，操作前用酒精喷雾。, 设 备, 紫外光灯, 空调, 放物架（或医用小平车：推送、放置培养基用；）,无菌操作用的器具：酒精灯、酒精消毒棉、解剖刀、弓背镊子、解剖针、剪刀等。, 超净工作台： 内设紫外灯、吹风装置、过滤装置等,每次实验前要用紫外灯灭菌分钟以上，然后喷酒精灭菌，工作过程中注意一直开着吹风机，并且一定要关掉紫外灯，过滤网应经常清洗。,其它部件：,离心机：分离原生质体用；,点融合仪：细胞融合用。,培养室,离体组织和试管苗生长发育的场所，,应为培养物创造适宜的温、光、气等条件。, 设计要求,培养室内要求内壁保温、光滑、室顶高左右，易于控制温、湿度，窗上要求装双层密封玻璃窗，室内有足够电源。, 作用, 设 备, 空调机：冷暖型, 加热器, 定时装置：控制光照时间, 培养架：放置培养瓶, 摇床和转床：悬浮培养, 各种光质灯管：光照培养, 温度计：控制温度, 遮光帘：供暗培养之用,、辅助实验室：,细胞学实验室,摄影室及暗室,生化分析室,细胞学实验室, 主要设备,各种显微镜，显微照相设备，切片、制片仪器设备，染色用具，暗房设备等。, 作 用,植物组织和细胞培养过程中，需随时观察记录其细胞学和形态解剖学的变化，故要设置细胞显微观察室。,理化分析试验室,细胞工程实验室基本设备配制小结,基本设备：冰箱、天平、酸度计,灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。,无菌操作设备：净化工作台、接种箱, 光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器。, 细胞培养设备：培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。, 细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜,基本操作技术,基本操作技术主要是围绕无菌操作技术展开的一系列操作技能，内容主要包括：,一洗涤技术,二灭菌、消毒技术,三、接种技术,一、 洗涤技术,、洗涤目的：去除杂物，降低带菌量,、根据洗涤对象的不同，主要分为：,器皿洗涤（包括玻璃、塑料、搪瓷、,不锈钢器皿）,培养材料洗涤,（一）器皿洗涤,根据洗涤对象的具体情况可分为以下三种：,特殊洗涤,微生物大量污染的洗涤,常规洗涤, 常规洗涤, 自来水洗去油渍、霉菌等脏物；, 温肥皂水中浸泡一定时间后用刷子刷净；,自来水冲洗干净，至瓶壁不挂水珠为止；, 蒸馏水淋洗内外壁, 将玻璃器皿倒置：晾干或烘干（）, 放入除尘柜中备用, 微生物大量污染的洗涤, 微生物污染器皿加压灭菌后再洗涤,特殊洗涤（如沾有蛋白质类物质或其它有机物时), 经过常规洗涤未过蒸馏水的器具，浸泡入洗液（铬酸洗涤液是用重铬酸钾()与硫酸()配制而成）中数分至数小时；, 回收洗液，器具先用自来水洗净，蒸馏水淋洗，烘干（）,（二）、试验材料的清洗,清洗目的：来自自然界的试验材料，包括来自土壤中的幼茎、磷茎，滋生着各种微生物，尤其是细菌的芽孢和真菌的孢子，一旦与培养基接触，就会很快的繁殖起来，造成培养基和培养材料的污染。,清洗方法：先用自来水冲洗分钟，然后用中性洗涤剂清洗，注意勿损伤试验材料。再用自来水流水冲洗半小时，用于下一步的药剂灭菌。,二、灭菌、消毒技术,（一）关于有菌和无菌的概念,有菌的范畴：,凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的，如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。,高压高温处理（工具、器皿、培养基等）,物理或化学处理；,火烤后的物体；,健康的动植物不与内外部表面接触的组织,内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但,不会影响培养，也不会污染）,无菌的范畴：,（二）灭菌、消毒技术作用和意义,植物组培中，凡用于培养和无菌操作的房间、器具、培养瓶、培养基，培养材料和操作者的衣物和手都应随时进行灭菌，以确保不受杂菌污染，否则，由于杂菌的生长繁殖速度一般都比培养的组织快得多，最终将把组织全部杀死，这些污染微生物还可能排泄对植物组织有毒的代谢废物，因此在培养容器内部保持一个完全无菌的环境是绝对必须的。,（三）灭菌、消毒种类,物理方法：,物理灭菌：高温高压灭菌（干热湿热）、烘烤或灼烧灭菌、射线处理、超声波等,物理除菌：过滤（微米） 、离心沉淀等；,化学方法：使用灭菌剂，如薰蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、苯酚、漂白精、新洁尔灭、次氯酸钠、过氧化氢）, 消毒、灭菌的对象：, 接种室, 材料（外植体）：,完全杀死材料表面的微生物过程：,洗洁精酒精氯化汞等,器皿用具消毒（灭菌）, 培养基,（三）、培养基、器具的灭菌,用灭菌锅灭菌：一般，灭菌分钟。自动锅：加足水后，调好时间、温度、即可自动运转。,手动锅:加足水后，关好，通电。待压力升到时，打开排气阀排除锅内的冷空气。然后关闭排气阀，升至 ( 左右)时计时，用通电、断电来保持分钟。待降至压力为时取出。,器具的灭菌：也可用烘箱 ，分钟,（四）、过滤除菌,培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些激素、玉米素等），就需要过滤灭菌或者两者结合。另外酶等也需要过滤灭菌；,灭菌方法：将激素或酶配成一定浓度，用注射器过虑，微米。配制培养基时，先将培养基高压灭菌，待温度降至左右时，加入适量的已过虑除菌的激素等，然后分装。,（五）、外植体的选择与消毒：,、外植体的选择,选择优良的基因型：蔬菜等作物、花卉等观赏植,物等的脱毒快繁选优良种。,取材：从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取,材。母柱代谢旺盛期窃取的外植体再生能力强，,试验容易成功。,外植体大小选择：如利用茎尖培养，脱毒快繁，,茎尖大小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养，,胚龄也非常重要。,选择外植体的时期,、外植体的消毒：,取材 将老的组织去掉 自来水冲洗,洗衣粉水洗（简单杀菌） 自来水冲洗,酒精处理 消毒剂处理 灭菌蒸馏水冲洗遍。,消毒时间，因材料老嫩程度不同有所不同。一般，较老的材料相对杀菌时间较长，反之，较短。一般杀菌，酒精秒，升汞分钟。,外植体在接种之前，须经严格的灭菌。与此同时，又要注意不损伤外植体。不同灭菌药剂杀菌力不同，故在使用不同的药剂时，需要考虑使用浓度和处理时间，对不同植物种类的不同外植体，处理也有不同。,另外，外植体在进入消毒剂之前，应认真取材及清洗，尽可能地减少其带菌量。,外植体除菌注意事项：,消毒剂 使用浓度() 消毒时间(分) 效果 残液去除难易,次氯酸钙 好 易,次氯酸钠 好 易,新洁尔灭 好 易,氯化汞 最好 最难,过氧化氢 较好 最易,抗菌素 较好 较难,几种常用消毒剂的效果比较,附：常用消毒剂的性质,酒精：,具有较强的穿透力和杀菌力，常作为表面灭菌的第一步，它具有浸润和灭菌的双重作用，但不能彻底灭菌，必须结合其他药剂灭菌。一般处理时间为。为了提高乙醇的杀菌效果，可在乙醇溶液中加入的酸或碱，因为和可改变细胞膜带电荷的性质而使透性增加，提高杀菌的效果,升汞（）：,剧毒的重金属盐杀菌剂，其杀菌原理是与带负电荷的蛋白质结合，使菌体酶蛋白变性失活。使用浓度，一般浸泡处理就可有效地杀死附着在外植体表面的细菌及真菌，灭菌效果极好。但用升汞灭菌的外植体材料须用无菌水反复多次冲洗，才能洗去残留的汞，否则会对外植体产生毒害作用。通常用无菌水冲洗不得少于次。由于升汞的毒性剧烈，使用中务必注意安全。,升汞废物的处理,升汞为剧毒药品，一则使用时注意别溅到皮肤上，二则使用后要进行处理，不能直接倒入下水道。,升汞处理方法：,升汞,絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止）,（中和过多的 ）,次氯酸钠（）：,用市售的“安替福民”配制的，灭菌时间，无菌水冲洗次。由于它分解出具杀菌作用的氯气，灭菌处理后易于除去，无残留，既有较强的杀菌力，又对植物无害，是常用的杀菌剂。,过氧化氢（双氧水）：,常用的溶液处理外植体材料，灭菌效果较好，由于该药剂在外植体表面容易除去，又不会损伤外植体，通常用于叶片材料的灭菌。,新洁尔灭：,一种广谱的表面活性灭菌剂。它对绝大多数植物外植体伤害很小，灭菌效果很好。通常使用：稀释液，处理或更长。,在用上述药剂进行材料的灭菌处理时，为了使杀菌剂湿润整个组织，有时还需在药液中加入润湿剂。如加入数滴或的吐温（）或吐温，或者用磁力搅拌、超声振动等方法使杀菌剂充分接触外植体，以利于彻底灭菌。,三、接种技术,所有的消毒、接种等无菌操作技术均需在无菌室的超净工作台上进行。,、超净工作台： 内设紫外灯、吹风装置、过滤装置等，每次实验前要用紫外灯灭菌分钟以上，然后喷酒精灭菌，工作过程中注意一直开着吹风机，并且一定要关掉紫外灯，过滤网应经常清洗。,、无菌操作用的器具：刀、镊子、剪刀、酒精灯等事先已灭菌，使用中避免交叉污染；,、操作人员在操作之前洗手、换工作服、双手消毒再操作。,培养条件,光照:光照强度、光质、光照时间,温度,湿度, 值：,渗透压,通气条件,根据离体培养的营养需求，培养基至少包括：,无机盐；,有机化合物；,生长调节剂,三、 培养基及其配制,培养基的基本成分,、,无机营养物质,、大量元素：,、,、(),、微量元素：,无机盐的作用：, 一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；, 二是构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶的活化剂，参与植物的代谢活动；, 三是这些元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化学方面的作用；, 四是在发育过程中，影响组织器官的建成。,浓度：,有机物质,糖：,作用：,维持培养基合适的渗透压,为细胞提供合成新物质的碳骨架,为细胞的呼吸代谢提供底物和能量,种类：蔗糖、葡萄糖,麦芽糖、果糖等,多糖：可溶性淀粉,维生素：,硫胺素()、烟酸（又称 ） 、泛酸()、吡哆醇()、酸铵、钴胺素()、叶酸(又称)、抗坏血酸()等等.,作用：利于细胞代谢和器官分化。 是植物组培必须加入的维生素，其用量在 之间，当组培中细胞分裂素特别少时，更为需要；烟酸和可促进细胞生长,氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、 天冬酰胺、丙氨酸等等。因培养基的种类不同，其添加种类和 浓度不同。,肌醇：又称环己六醇，促进糖类的相互转化、维生素、 激素的利用作用，使培养物快速生长 。,腺嘌呤、硫酸盐等激素：加入培养基时，可促进芽、根的形成和生长。根 据培养基的植物不同，决定是否添加。,琼脂:是从海藻中提取的一种高分子碳 水化合物，其主要作用是使培养基在常温下凝固，但不参与代谢。,活性炭:主要目的是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，如可以防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。,、附加物,这类物质为非植物细胞生长所必须，但对细胞,生长有利,主要包括琼脂和活性炭。, 作用：提供一些必要的微量营养成分、,生理活性物质和生长激素等。, 这类物质常指天然提取物 ：,麦芽提取物、,椰乳、,鲜果汁、,酵母提取物,、 其它有益有机添加物或未知复合成分,、值：,即酸碱度，培养的植物材料大多数要求弱酸性的环境，一般将培养基调整至。常用氢氧化钠或盐酸来调节培养基的。,注意：,第一、经高温高压灭菌后，培养基的会下降,故调整后的应该高于目标 个单位;,第二、 的大小会直接影响到琼脂的凝固能力，一般 大于时，培养基就会变硬，低于时琼脂就不能很好地凝固,、激素,在培养基中，其各种成分对培养物影响最大的最显著的就是激素。激素的种类、浓度、以及配比都会显著的影响愈伤组织的形成、不定根、不定芽的分化，胚状体的形成等；, 组织培养中使用的激素有的是天然的，如脱落酸（）等，有的是合成的，如二氯苯氧乙酸（，）。,（一）、激素的种类,、生长素,、细胞分裂素,、赤霉素,、脱落酸,、生长素类, 生长素是指能引起完整组织中的细胞扩展的化合物。,在自然界中，即内生生长素影响茎和茎节的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象, 在组织培养中的主要作用是：诱导愈伤组织的产生，促进细胞脱分化，促进细胞的伸长，促进生根。, 组织培养中常用的生长素有：,二氯苯氧乙酸（，） ； 萘乙酸（）,吲哚乙酸（ ） ； 吲哚丁酸（）,萘氧乙酸（） ； 对氯苯氧乙酸（）,三氯苯氧乙酸（， ）； 生根粉（）,、 易引起生根， ， 、， 有利于愈伤组织的诱导和生长。,主要作用：是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生；,作用的强弱顺序为：,，,溶解方法：,或酒精，以前者为好,保存：,配成一定浓度后，冰箱冷藏保存,、细胞分裂素,自然界中，细胞分裂素影响细胞分裂，顶端优势的变化和茎的分化等；, 组织培养中，细胞分类素主要促进细胞分裂和愈伤组织上或器官上分化不定芽，叶片扩大和茎长高，抑制根的生长。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。,常用的细胞分裂素有：, 苄基嘌呤（） ；, 苄基腺嘌呤（）；,激动素（呋喃氨基嘌呤、）；,玉米素（）；,异戊烯氨基嘌呤（）,噻二唑苯基脲（ 、 ）；,溶解方法：,保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存,主要作用：促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用；,作用的强弱顺序为：。,、赤霉素,赤霉素能够打破休眠、促进果实成长等效果；,赤霉素有多种，其中在组织培养中最常用的是；,已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究；能刺激不定胚发育成正常小植株；在培养基中很少添加，因为它的作用往往是负面的。,溶解方法：酒精,保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存；,赤霉素易溶于水，但溶于水后不稳定，容易分解；,灭菌：高温分解，过滤灭菌。,、脱落酸,脱落酸能阻碍发育、促进老化、形成休眠芽等作用；,加上脱落酸能抑制生长，是继代培养时间延长；,溶解方法：酒精；,保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存。,（二）、常见培养基中植物激素配方类型,激 素 配 方,再生方式及用途,.无植物激素,诱导生根、无性胚、愈伤组织形成,.单加生长素,诱导生根、愈伤组织、无性胚、不定芽,.单加细胞分裂素,诱导不定芽、侧芽增殖、愈伤组织形成,.高生长素低细胞分裂素,诱导芽、原球茎增殖、愈伤组织形成,.低生长素高细胞分裂素,诱导丛芽、愈伤组织形成,.低生长素低细胞分裂素,诱导不定芽、侧芽增殖,.等量生长素与细胞分裂素,诱导侧芽增殖,.加生长仰制剂（多效唑、矮壮素等）,壮苗、延缓生长、利于试管苗保存,.加,打破种子、芽休眠，促进伸长生长,名称,分子量,溶解性质,主要作用,吲哚乙酸（）,易溶于热水、乙醇、乙醚、丙酮,促进细胞的延伸生长和细胞壁结构的松驰，也可用于诱导生根,吲哚丁酸,(),溶于醇、丙酮、醚稀碱、稀酸液,为生根刺激剂,萘乙酸,(),易溶于热水、丙酮、醚、乙酸、稀碱液,促进细胞生长，刺激生根,二氯苯氧乙酸(),易溶于醇、丙酮、乙醇、稀碱液,促进愈伤组织形成,赤霉酸(),易溶于醇、乙酸乙酯、碳酸氢钠和醋酸钠的水溶液，其钠,促进茎、叶伸长生长，打破休眠,（三）、常见生长调节剂及主要性能一览表,（四）、常见生长调节剂的微摩尔升浓度与毫克升的换,微摩尔,/,升,毫克,/,升,IAA,IBA,NAA,2,4-D,KT,BA,2iP,ZT,TDZ,GA3,1,0.175,0.2032,0.1862,0.2210,0.2152,0.2253,0.2027,0.2190,0.2202,0.3464,2,0.3504,0.4064,0.3724,0.4421,0.4304,0.4505,0.4054,0.4380,0.4404,0.6927,3,0.5255,0.6094,0.5586,0.6631,0.6456,0.6758,0.6081,0.6570,0.6606,1.0391,4,0.7007,0.8128,0.7448,0.8842,0.8608,0.9010,0.8108,0.8760,0.8808,1.3855,5,0.8759,1.0160,0.9310,1.1052,1.0761,1.1263,1.0135,1.0950,1.1010,1.7319,6,1.0511,1.2192,1.1172,1.3262,1.2913,1.3516,1.2162,1.3140,1.3212,2.0782,7,1.2263,1.4224,1.3034,1.5473,1.5065,1.5768,1.4189,1.5330,1.5414,2.4246,8,1.4014,1.6256,1.4896,1.7683,1.7217,1.8021,1.6216,1.7520,1.7616,2.7710,9,1.5766,1.8288,1.6758,1.9894,1.9369,2.0273,1.8243,1.9710,1.9818,3.1173,三、常用培养基的种类、配方及其特点,（一）、培养基的种类,、培养基，根据其态相不同分为固体培养基与液体培养基。固体培养基是指加凝固剂的培养基；液体培养基是指不加凝固剂的培养基，培养基加入一定量的凝固剂，加热溶解后，分别装入常用的培养基中冷却后即得到固体培养基。,、根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基和继代培养基。初代培养基是指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基是指用来接种继初代培养基之后的培养物的培养物。,、根据其作用不同，培养基分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。,、根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。基本培养基（就是通常称呼的培养基）主要有、 、 、改良、 等。完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。,（二）几种常见培养基：,、米勒、改良怀特、尼特、努森等。,培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，能保证组织培生长所需的矿物质营养。并且因为离子浓度高，在配制、贮存、消毒过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响培养基中的离子平衡,四、培养基的配制,（一）、贮备液（母液）的配制,为什么要配制母液？,）、方便,）、准确（有些成分量太小）,）、母液要分类配，,否则有些成分混合一起会产生沉淀,以培养基为例：,表培养基母液的配制,成分,培养基配方（）,每升母液的用量（）,母液扩大倍数,每升培养基用量（）,大量元素（母 液,）,微量元素,（母液,）,铁盐母液 ,有机成分,（母液,）,甘氨酸,盐酸硫胺素,盐酸吡哆素,烟酸,肌醇,贮备液（大量元素） 倍,贮备液（微量元素） 倍,贮备液 （铁盐） 倍,贮备液 （有机成分） 倍,母液、按表称量药品溶解定容冰箱冷藏,母液，和称量后，分别溶于水中,，加热，然后混合一起；或者混合一起后加热，颜色黄色变深，生成 ,冷却后，冰箱冷藏。,（二）、培养基的配制,、向烧杯加入适量的水，按量加入种贮备液（母液）,、按所需浓度加激素，或其他成分，如等,、加蔗糖，一般,、值测定 值测定仪，、，、调整,、加琼脂 ，一般，溶化（电炉、微波炉等）,、分注、封口（铝箔纸，牛皮纸、塑料纸等）,、灭菌 ，分钟（并不是灭菌时间越长越好，灭菌时间过长会导致培养基内的某些成分变性失效）,灭菌后，应尽快地转移培养瓶使其冷却，一般应将灭菌后的培养基储藏于以下的室内名，最好储藏在的条件下。,应当注意的是，某些生长调节物质如、等以及某些维生素是不稳定的，不能和其他的培养基一起高压灭菌，而要进行过滤灭菌。,小结,实验室设计要合理、科学，同时要配备必要的仪器设备；,培养基在配置时要参考常规的细胞培养营养要求，同时要考虑特定细胞的特殊营养要求。,