肿瘤分子诊断课件

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,Target Assay for NSCLC,EGFR Gene Mutations Detection,非小细胞肺癌靶向治疗之靶标分析,表皮细胞生长因子受体基因突变检测,宝藤临床检验中心,肿瘤分子诊断服务介绍,2,标准化用药,个体化用药,标准化用药,个体化用药,标准疗法,1,标准疗法,2,标准疗法,3,9/11/2024,肿瘤药物与相关靶标,9/11/2024,3,4,如何实现个体化用药？,分子分型 药物疗效,9/11/2024,目前的服务,目前的平台,目前的客户,肿瘤,TaqMan-ARMs,医院,感染性疾病,测序,健康管理公司,新生儿筛查,实时定量,PCR,研究所,qPCR-HRM,药厂,循环肿瘤细胞（,CTC,）,保险公司,9/11/2024,5,体细胞基因突变检测,mRNA,表达检测,循环肿瘤细胞（,CTC),检测,基因多态性检测,9/11/2024,6,体细胞基因突变检测,EGFR, K-RAS, B-RAF,，,C-KIT,9/11/2024,7,1,、基因,突变,检测技术,8,qPCR-HRM,（可用于血浆标本检测）,Taqman-ARMS,（与国际获批的技术相当）,DNA,测序（基因突变检测的金标准技术）,9/11/2024,突变检测技术之一,Taqman-ARMS,9,所有定量,PCR,仪均可使用。,主要用于各类组织，包括手术、穿刺或镜检组织类。,2,小时即可完成检测,试剂盒商业化程度高，临床认可程度高,国内已有试剂盒获批,SFDA,9/11/2024,突变,检测技术之一,qPCR-HRM,10,qPCR-HRM,技术是基于高效稳健的,PCR,上的高分辨熔解曲线分析（,High-Resolution Melting）,技术，灵敏度可以达到,1%-0.1%,，既能检测已知突变，也能检测未知突变。,qPCR-HRM,的突变检测已获国际多中心双盲实验验证（,Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 11, No. 6, November 2009,）,。,实例图：利用,HRM,技术对,7,个样本分别进行,EGFR,（左图）、,KRAS,（右图）突变检测，红色表示该样本发生突变，蓝色表示未突变，蓝色横直线为阴性对照。左图显示,2,个样本发生了,EGFR,突变；右图显示,4,个样本发生了,KRAS,突变。,EGFR,KRAS,9/11/2024,11,血浆,EGFR,突变检测：,18,号外显子：无突变,19,号外显子：突变,20,号外显子：无突变,21,号外显子：无突变,附图,主要特点：,实现血浆中来自肿瘤的微量,DNA,的,突变检测。,目前所做的临床实验,中，,血浆,EGFR,检测结果,与,其,手术标本,之间的整体符合率,符合率达到,91.25%,。,是临床上不能手术、也同时不愿穿刺患者的替代检测方案；也可 获得性耐药进行预先检测。,qPCR-HRM,用于血浆微量突变检测,9/11/2024,国际公认的分子检测金标准,有明确的物价收费,实验流程较复杂，需要大型仪器,突变,检测技术之一,DNA,测序,9/11/2024,12,肿瘤类型,靶向药物,基因,疗效佳的情况,非小细胞肺癌,易瑞沙（,Iressa,）,特罗凯（,Tarceva,）,EGFR,KRAS,EGFR,突变,/KRAS,野生,胃肠间质瘤,格列卫（,Gleevec,）,C-Kit,C-kit,第,11,外显子突变,/PDGFR,突变,结直肠癌,爱必妥,KRAS,BRAF,野生型,突变检测项目列举,9/11/2024,13,EGFR,突变检测,EGFR E19 / E21,敏感突变,适合使用,TKI,药物治疗,耐药位点检测,T790M,9/11/2024,14,K-RAS,突变检测,9/11/2024,15,BRAF,NCCN,2010,年,NCCN,结直肠,癌临床实践指南,指出：,K-ras,基因,为野生型而同时具有,BRAF V600E,突变的患者，靶向,EGFR,抗体治疗无效,。,BRAF-V600E,检测,肿瘤学临床实践指南（中国版）,2010,第一版,9/11/2024,16,指导肿瘤靶向治疗的靶标,药物名称,检测靶标,检测内容,检测结果,预测内容,吉非替尼,/,厄洛替尼,EGFR,基因突变,野生型,耐药,突变型,敏感,西妥昔单抗,K-ras,，,B-raf,基因突变,野生型,敏感,突变型,耐药,伊马替尼,C-Kit,基因突变,野生型,耐药,突变型,敏感,9/11/2024,17,基因多态性检测与药物代谢毒性,(UGT1A1,CYP,DPD),9/11/2024,18,2024/9/11,19,单核苷酸多态性（,SNP,）是最常见的基因变异,至少,1%,的人群,绝大多数人群,共有序列,G to C,SNP,位点,变异的序列,最常见的基因多态性,SNP,2024/9/11,20,为什么,SNPs,重要,?,个体,1,个体,2,= SNP variations in DNA,SNP,标志基因,A,基因,B,基因,A,SNP,可能使基因,B,产生变异的蛋白质分子,2024/9/11,21,个体的,SNP,谱,SNP,谱,A,SNP,谱,B,SNP,谱,C,SNP,谱,F,SNP,谱,E,SNP,谱,D,2024/9/11,22,SNP,谱有助于确定药物的疗效和副作用,乳腺癌病人,个体的,SNP,谱可以分成不同的类型,SNP,谱,A,对药物有期望的反应,对药物没有期望的反应,SNP,谱,A,的人对药物,有期望的反应,SNP,谱,E,SNP,谱,B,SNP,谱,C,SNP,谱,D,药物代谢与,SNP,检测,化疗药物在体内经过吸收、代谢、分布和清除，通过其活性物质对治疗靶点的直接攻击而发挥作用，整个过程需要多种蛋白质,/,酶的共同参与和协同作用。,SNP,主要是指在基因组水平上变异频率大于,1%,的单核苷酸变异所引起的,DNA,序列多态性，多态性会导致不同个体体内各种蛋白，酶活性的差异，因此导致药物使用情况的不同。,9/11/2024,23,胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因（,UGT1A1,）,UGT1A1*27(C686A),或,UGT1A1*28(TA),7,TAA:,野生型：,6,个,TA,UGT1A1*6(G211A),：,使,UGT1A1,的转录活性下降了三分之二。,导致对伊立替康的毒性增加。,FDA,提示：,UGT1A1,的多态性,-,伊立替康的毒性增加,(6TA),此型的酶活性是野生型的,49,。,9/11/2024,24,CYP19A1,多态性影响芳香化酶抑制剂疗效,25,CYP19A1,是芳香化酶的编码基因，临床研究已证实有着很大的影响作用。在接受芳香化酶抑制剂治疗的乳腺癌患者中，携带,CYP19A1,基因,rs4646,（,GT,）突变患者的治疗效果较无此突变的患者显著,2-4,（下图）。,CYP19A1 rs4646,（,GT,）,SNP,是乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂治疗疗效的有效预测指标,。,如图一项对乳腺癌患者的临床研究显示：,CYP19A1,基因,rs4646,突变的患者使用芳香化酶抑制剂药物疗效明显优于野生型患者（,p0.0001,）,1,。,参考文献,1. Ian ES et al. N Engl J Med. 2003;384:2431-42.2. Ramon C et al. Clin Cancer Res. 2008;14:811-6. 3. Lunardi G et al. J Clin Oncol. 2009; 27: 555. 4. Fasching PA et al. Breast Cancer Res Tr. 2008;112:89-98.,9/11/2024,基因表达检测（,mRNA,表达）,(ERCC1BRCA1TUBB3TS),9/11/2024,26,基因表达检测指标（靶向药物）,相关肿瘤,药物名称,检测靶标,检测内容,检测结果,预测内容,结直肠癌,贝伐单抗,VEGFR,mRNA,表达水平,高,疗效好,低,疗效差,乳腺癌,曲妥珠单抗,HER-2,FISH/,mRNA,表达水平,高,疗效好,低,疗效差,肝癌,索拉非尼,pDGFR,mRNA,表达水平,低,疗效好,高,疗效差,9/11/2024,27,28,靶向药物,项目名称,样本,结果,疗效,关系,曲妥珠,单抗,HER2,乳腺癌（手术,/,穿刺）,+,阳性疗效好,-,HER2,基因表达,检测,采用,RT-PCR,方法替代,FISH,或免疫组化方法，临床准确率达,97%,以上。,主要特点：,客观，不用人为观察。,时间短，整个检测,60,分钟左右完成。,高通量，一次可以检测,6,人份。,9/11/2024,28,PDGFR,低表达,患者的无进展生存期和总生存期明显,长于高表达,患者,索拉菲尼检测基因,-PDGFR,9/11/2024,29,贝伐单抗检测基因,-VEGFR,9/11/2024,30,化疗药物与检测靶标,药物名称,检测靶标,检测内容,奥沙利铂,/,卡铂,/,顺铂,ERCC1/BRCA1,mRNA,表达水平,5-FU/,培美曲赛,TS,mRNA,表达水平,紫杉醇,/,多西紫杉醇,/,长春瑞滨,STUBB3,STMN1,mRNA,表达水平,替莫唑胺,MGMT,mRNA,表达水平,阿霉素,/,表柔比星,TOPOa,mRNA,表达水平,吉西他滨,RRM1,mRNA,表达水平,9/11/2024,31,ERCC1,表达与铂类药物疗效相关的临床数据,ERCC1,阴性患者，能从铂类辅助化疗中获益,.,9/11/2024,32,BRCA1/2,表达与铂类药物疗效相关的临床数据,BRCA1,过度表达,铂类耐药的预测因子,抗微管类药物的敏感因子,9/11/2024,33,34,低,TS mRNA,水平的肿瘤患者接受氟类化疗的效果较好，中,位生存期较长。,TS,低表达的患者对培美曲赛的疗效好。,TS,高表达影响氟类和培美曲塞药效,Shirota Y et al. J Clin Oncol. 2001;19:4298-304,9/11/2024,化疗药物与检测靶标,药物名称,检测靶标,检测内容,检测结果,预测内容,奥沙利铂,/,卡铂,/,顺铂,ERCC1/BRCA1,mRNA,表达水平,高,疗效差,低,疗效好,5-FU/,培美曲赛,TS,mRNA,表达水平,高,疗效差,低,疗效好,紫杉醇,/,多西紫杉醇,/,长春瑞滨,STUBB3,STMN1,mRNA,表达水平,高,疗效差,低,疗效好,替莫唑胺,MGMT,mRNA,表达水平,高,疗效差,低,疗效好,阿霉素,/,表柔比星,TOPOa,mRNA,表达水平,高,疗效好,低,疗效差,吉西他滨,RRM1,mRNA,表达水平,高,疗效差,低,疗效好,9/11/2024,35,小 结,分子靶标分类,靶向药物靶标,基因突变,EGFR,突变,K-RAS,突变,B-RAF,突变,基因表达,VEGFR,表达,pDGFR,表达,HER-2,表达,化疗药物靶标,基因表达,ERCC1,表达,TS,表达,RRM1,表达,基因多态性,UGT1A1,多态性,CYP19A1,多态性,DPD,多态性,9/11/2024,36,药物名称,靶标,检测内容,化疗药物,铂类,ERCC1,，,BRCA1,mRNA,水平，,2,项,XRCC1,，,GSTP1,，,MRP2,基因多态性，,4,项（女，,6,项）,BRCA1(,女,),异环磷酰胺,CYP2C9*3,基因多态性，,1,项,丝裂霉素,NQO1,基因多态性，,1,项,依托泊苷,Topo,mRNA,水平，,1,项,CYP3A4*4 ,MDR1,基因多态性，,2,项,紫杉醇,/,多西紫杉醇,/,长春瑞滨,TUBB3,STMN1,mRNA,水平，,2,项,CYP8*3,基因多态性，,1,项,伊立替康,UGT1A1*6,UGT1A1*28,基因多态性，,2,项,吉西他滨,RRM1,mRNA,水平，,1,项,CDA,基因多态性，,1,项,培美曲赛,TS,mRNA,水平，,1,项,靶向药物,吉非替尼,/,厄洛替尼,EGFR (Exon19/20/21),基因突变，,3,项,西妥昔单抗,K-ras , B-raf,基因突变，,3,项,EGFR,mRNA,水平，,1,项,贝伐单抗,VEGFR,mRNA,水平，,1,项,NSCLC,个体化用药系统方案,9/11/2024,37,遗传性非息肉性结直肠癌（,HNPCC),是由,DNA,错配修复基因（,MMR),发生基因突变导致的一种单基因的显性遗传疾病，又称,lynch,综合症，发生基因异常的个体其患发结直肠癌的风险约为,60%,。,HNPCC,实验室检测流程,9/11/2024,38,1,背景介绍,之,HNPCC,与,MMR MSI,目前已发现的导致人类,HNPCC,发生的,MMR,有,MSH2,、,MLH1,、,MSH6,、,PMS1,、,PMS2,，其中,MSH2,和,MLH1,基因,的功能最重要，其,突变占已发现突变的,90%,左右,。,39,9/11/2024,1,背景介绍,之,HNPCC,与,MMR MSI,研究显示，,约有,86%-95%,的,HNPCC,具有,MSI,特征，,而散发型大肠癌中只有,16%,。,MSI,所产生的遗传不稳定性将加速恶性肿瘤的发生。,1997,年美国,NCI (national cancer institution),将,MSI,确定为检测和筛选,HNPCC,的重要方法之一，并推荐将,BAT26,、,BAT25,、,D2S123,、,D5S346,和,D17S250 5,个位点作为检测,HNPCC,的位点。,40,9/11/2024,实验室检测流程,MSI,检测,MLH1,，,MSH2,，,MSH6,突变筛查,MLH1,，,MSH2,，,MSH6,热点突变检测,9/11/2024,41,HNPCC,检测项目,检测名称,检测技术,临床意义,MSI,（,5,个位点）,PCR+,片段分析法,HNPCC,风险评估,明确是否检测,MMR,突变,MLH1,MSH2,MSH6,基因突变检测（,35,个外显子）,DNA,测序,HNPCC,鉴别诊断,确定突变位点，评估家族中高危个体风险,热点突变检测,DNA,测序,确定家族中是否存在已知的突变,9/11/2024,42,标本要求,检测名称,标本要求,MSI,检测,病理蜡块一份（或白片,10,片），外加,5ml,抗凝外周血，,4,度运达,MLH1,MSH2,MSH6,基因突变检测,病理蜡块一份（或白片,10,片），常温运达,热点突变检测,5ml,抗凝外周血，,4,度运达,9/11/2024,43,肿瘤在变,We can look at tumors for,changes,at the DNA, RNA and protein levels. It certainly gives us a way of looking at what is happening,inside,a tumor, and thats very,exciting,.,Dr. Gordon Mills,Chair Systems Biology,MD Anderson Cancer Center,Houston, Tx,As reported in,“,The Cancer Test,”,TIME,(June,14, 2007), Med J,，,Ashworth,最早在转移性癌症患者血液中观察到。,2005,年,N Engl J Med,，,Cristofanilli,证实治疗前,CTC,数目是转移性乳腺癌患者无进展生存期和总生存期的独立预测因子。,循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。,原发肿瘤血管生成侵润,侵入血管内,侵入血管外,(CTC),血管内增殖,(CTM),转移,转移,播散肿瘤细胞（,DTC,）微转移休眠灶,循环肿瘤细胞（,CTC,）,循环肿瘤,微栓,（,CTM,）,凋亡的,CTC,侵润,肿瘤细胞,扩增,血管生成,上皮间质转化,（,EMT,）,间质上皮转化,（,MET,）,转移到骨髓和其他器官,9/11/2024,45,获取,CTC,需要解决的技术问题,从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞,将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常上皮细胞、造血干细胞等区分开来,每,10mL,血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞，而,10mL,血液中含有的白细胞约有,1,亿个，红细胞有,500,亿个。,9/11/2024,46,三种技术,过滤法,ISET: Isolation by Size of Epithelial Tumor cells,8m,孔径过滤膜，漏检体积较小的肿瘤细胞,敏感性低,梯度密度法,肿瘤细胞和单核细胞密度小于,1.077g/ml,CTC,纯度低，混入较多白细胞,肿瘤细胞会迁移至血浆层，而聚集后容易下沉,聚蔗糖,-,泛影葡胺,(Ficoll-Hypaque),对细胞有毒性,免疫磁珠法,肿瘤细胞表面抗原,EpCAM,与包绕着磁珠的特异性单抗相结合,CellSearch,细胞保存方法长达,96,小时,实验室室间差异小,EpCAM,的假阳性和假阴性,9/11/2024,47,90,年代中期开始摸索捕获、分析,CTC,的方法,1999-2003,大量临床实验建立,CellSearch,与,CTC,的临床相关数据,2004,获得美国,FDA,批准用于临床,2009,Cleveland Clinic,十大医学突破第一名,2009 Prix Galien USA,最佳医学技术奖,2010.1,中国,CTC,在复发转移乳腺癌上的应用注册实验,2011,.5,CTC,在小细胞肺癌上的应用实验研究,CellSearch,是全球第一也是唯一经,FDA,批准可用于临床的循环肿瘤细胞（,CTC）,产品,1983,磁流体,9/11/2024,48,白细胞,Anti-CD45,CD45,Nucleus,DAPI,如何鉴别出,CTC?,藻红蛋白,(PE),变藻蓝蛋白,(APC),CTC,Anti-EpCAM,磁珠,Anti-CK-PE,Nucleus,DAPI,CK,EpCAM,在,CellSearch,检测中，,CTC,被设定为：,EpCam,CK-8,18,和,/,或,19,DAPI,CD45,+,+,+,-,9/11/2024,49,CellSave,储存管,CellSearch,CTC,检测试剂盒,CellSearch:,自动化的,CTC,分离、富集和计数,CellTracks,AutoPrep,系统,磁巢,Magnest,CellTracks,Analyzer II,96,小时稳定,2004,年,FDA,批准,CTC,质控试剂盒,磁力,捕获,FIRST AND ONLY,APPROVED,9/11/2024,50,切点的意义,评估预后,9/11/2024,51,CTC,数量变化是预后改变的重要预测,9/11/2024,52,CTC,计数,CTC,的分子特性,指示预后,快速疗效评估,辅助检测抗癌药物的反应,作为预测和,/,或药物动力学生物标志物,判断病人是否需要辅助化疗,检测癌症复发,辅助诊断,实时活检,肿瘤的生物学行为,阐明预后和预计的分子学特征,检测抗药情况,基于获得连续样本的便利性,提高对生物过程机制的了解,发现并鉴定新治疗靶点,CTC,的应用：从细胞计数到分子特性,9/11/2024,53,