细菌内毒素检查技术培训班讲义课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2007-9-10,*,细菌内毒素检查技术,讲义,2007-9-10,1,目 录,一、细菌内毒素检查的基础理论,二、 试验前的准备,三、细菌内毒素检查的实验技术,，鲎试剂灵敏度复核,，干扰初筛试验,，干扰试验,，检查法,四、细菌内毒素检测技术的发展,2007-9-10,2,一、细菌内毒素检查的基础理论,，细菌内毒素,，鲎试剂,，用水,，程序,，年版细菌内毒素检查法,，相关参数的计算,，试验的相关知识,2007-9-10,3,、细菌内毒素）化学成分及特性,革兰氏阴性细菌细胞壁的产物,是高分子量脂多糖复合物（）,除上述性质外，还有许多其他的生物活性,致热,性,耐热,性,酸碱性,与鲎试剂反应,分子极性,需要在250摄氏度干热至少3060分钟才能彻底灭,活,多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性，,在水中呈不均匀分布,内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原，再刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应,与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝,胶,与强酸强碱水解反应,（）特性,2007-9-10,4,内毒素的分子结构,（）化学结构,含有个截然不同的区域, 特异侧链,核心多糖,类脂,2007-9-10,5,） 内毒素与热原的关系,内毒素是热原之一种 医药工业接受的观点是，内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原，控制内毒素污染就等于控制热原污染。,）标准内毒素和环境内毒素）标准内毒素经人工提取精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为检查的参考品或对照品。主要分参考标准品（）及工作标准品（）。的效价必须用来标化。目前的效价有两种标示方法：固定效价法（中国）及浮动效价法（国际）。）环境内毒素天然产生的内毒素，普遍存在于水、空气及各种原料中，成分除了脂多糖外还含有较多的蛋白质、多糖和其他杂质，其极性不明显，致热性较标准内毒素弱。的对象是环境内毒素。,2007-9-10,6,）标准内毒素溶液（溶液）的制备,）中国药典年版的法规定，将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解后，需在旋涡混合器上混匀分钟，以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀秒钟，其他国家药典都有类似要求,具有极性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布,2007-9-10,7,、鲎试剂,）鲎试剂的分类,根据鲎的种类分类,美洲鲎试剂(),中国鲎试剂或东方鲎试剂（）,根据检查方法分类,凝胶法鲎试剂,光度法鲎试剂,根据鲎试剂的反应特异性分类,普通鲎试剂,特异型鲎试剂,2007-9-10,8,）鲎试剂的规格,一般分单次试验试剂和多次试验试剂（也称大装量试剂）,把自身的包装容器作为反应管的试剂称为单次试验试剂，在国内使用的支的鲎试剂就属于单次试验试剂,多次试验试剂有支、支等，使用时应先用相应量的溶解液复溶鲎试剂。,2007-9-10,9,）鲎试剂的质量标准,灵敏度,定义：再细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生凝集的标准内毒素的最低浓度，单位。,常用鲎试剂的灵敏度：、 、 、 、,自身凝集,部颁标准，鲎试剂的阴性对照在度小时不产生凝集反应,缓冲能力,干燥失重,无菌：中国标准无此项要求,2007-9-10,10,）鲎试剂与内毒素的反应机理,因子,活化的因子,内毒素,活化的因子,因子,凝固酶,凝固酶原,凝固蛋白（凝胶）,凝固蛋白原,葡聚糖或,活化的因子,因子,二价阳离子,（酶作用物）,测吸光度值,（对硝基苯胺,黄色）,2007-9-10,11,、用水,年版药典要求，用水应为与或更高灵敏度的鲎试剂在条件下小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。,年版药典要求，凝胶法用水应为内毒素含量小于的灭菌注射用水；光度测定法用的用水内毒素含量应少于。,美国药典要求的用水是指与所使用的鲎试剂不发生反应的灭菌注射用水或其他水。,2007-9-10,12,、程序,）验证实验,凝胶法,光度测定法,）检查法,凝胶法,光度测定法,动态法 终点法：终点比色法试验,灵敏度的复核试验,干扰试验,标准曲线可靠性试验,干扰试验,凝胶限量试验,凝胶半定量试验,动态比浊法试验,动态比色法试验,动态终点法,2007-9-10,13,、中国药典年版细菌内毒素检查法,）综述部分,细菌内毒素检查法的定义及方法学分类,内毒素标准品及检查用水,器具的要求,供试品溶液的要求,内毒素限值的确定,最大有效稀释倍数的计算,2007-9-10,14,）试验部分,（）凝胶法,鲎试剂灵敏度复核试验,干扰试验,检查法,（）光度测定法,标准曲线的可靠性试验,干扰试验,检查法,）年版药典法际验部分主要内容,凝胶限量试验,凝胶半定量试验,2007-9-10,15,鲎 试 验 方 法,凝胶法,光度测定法,限量法,半定量法,动态法,终点法,动 态浊度法,动 态显色法,终 点浊度法,终 点 显色法,灵敏度,以标示灵敏度表示,以标准曲线最低浓度表示,预试验,灵敏度复核试验各浓度平行管, 管,标准曲线验证试验各浓度平行管， 管,有效条件,阴性, （对动态法而言）,预试验,干扰试验,干扰试验,无干扰条件,、阴性 , ,检查法,、各平行管(共管),、各平行管(共管),有效条件, 、阳性 阴性, ,2007-9-10,16,）内毒素限值,（）药品、生物制品的细菌内毒素限值（）一般按以下公式确定：,为供试品的细菌内毒素限值，以、(活性单位)表示；,为人每公斤体重每小时科接受的最大内毒素剂量，以()表示，注射剂 (),放射性药品注射剂 (),鞘内用注射剂 (),为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以()、()、 ()表示，人均体重按计算，注射试剂若不足小时，按小时计算。,、相关参数的计算,2007-9-10,17,（）内毒素限值计算举例,注射用的头孢曲松钠舒巴坦钠，成人最大剂量为次,注射用人头孢孟多酯钠，成人每日剂量为至，分至次给药，一日最高剂量不超过,对于大输液（）,美国药典（）通常都取值为,(),(),(),() (),2007-9-10,18,）最大有效稀释倍数,供试品最大有效稀释倍数（）按以下公式计算,为供试品溶液的浓度，其中当以表示时，为;当以或表示时的单位为或 。凝胶发中，为鲎试剂的灵敏度,光度测定法中，为标准曲线最低浓度,如使用鲎试剂灵敏度为，注射用头孢曲松钠舒巴钠（浓度为）的最大有效稀释倍数为,(倍),2007-9-10,19,）最低有效稀释浓度(),如使用鲎试剂灵敏度为，注射用头孢曲松钠舒巴钠的最低有效浓度为,) 样品稀释过程中加液量的计算,稀释过程中，假设从溶液取（）溶液稀释（）倍至，加液量为（）,则满足：,(),如从溶液取稀释倍至,则加液量为：,(),即的加稀释液即得的倍稀释液,2007-9-10,20,、试验相关知识,) 内毒素标准品的使用,（）复溶,复溶安瓿装的内毒素标准品，为了避免溶液再混合时溢出安瓿，我们建议在安瓿颈部上方开口加液。,复溶液的体积一般为,或根据使用说明书加液。,（）效价,厂家必须向用户提供一份效价分析证书（ ）,效价分析证书应注明： ; 瓶,2007-9-10,21,) 鲎试剂的使用,使用前，应将鲎试剂置于室温环境下使其大道室温温度鲎再复溶使用,复溶鲎试剂鲎，应避免强烈振动产生泡沫,由于鲎试剂与内毒素凝集反应的不可逆性，反应过程中必须避免反应试管的振动造成假阳性,）内毒素的清除,（） 冲洗,适用于器械组件、塞子等,可用于加热等方法提高清除效率,（）蒸馏，折流系统和地心引力阻止大分子量的转变为蒸汽状态逸出,（）反渗透 （） 超滤 （）活性炭吸附,2007-9-10,22,）内毒素的灭活,（） 酸碱水解,（）氧化,（）干热,，分钟的干烤,2007-9-10,23,二、试验前的准备,. 在细菌内毒素检查试验中，凡是与试验样品或试剂接触的器具必须经过除热原处理。,玻璃器皿一般用洗液浸泡小时后，用自来水冲洗，再用真馏水冲洗、晾干。最后在干烤至少分钟。,2007-9-10,24,. 试验所试用的器具主要包括有：,无热原稀释管,无热原玻璃移液管,无热原玻璃毛细管,稀释试管架,安瓿试管架,反应试管架,可调移液器,连接胶粒,无热原吸头,安瓿开启器,的异丙醇浸泡的无纺布拭布,2007-9-10,25,. 实验中也可用一次性的无热原塑料器械。,如用可调移液器和无热原吸头代替无热院玻璃移液管取液等。,在使用可调移液器连接无热原毛细管吸取微量溶液时，采用多吸少打方式。避免由于毛细管的虹吸作用带来的加样误差；也可避免微量加样时产生气泡。,2007-9-10,26,. 细菌内毒素检查实验的恒温反应在的恒温器中进行。,型试管恒温仪（安度斯设计生产），专门用于细菌内毒素检查的恒温仪器。具有, 温度稳定；, 加热均匀；, 定时报警等特点,2007-9-10,27,三、凝胶法细菌内毒素检查技术,，凝胶法试验程序,，试验器具,，鲎试剂灵敏度复核,，干扰初筛试验,，干扰试验,，检查法,2007-9-10,28,、凝胶法的实验程序,）试验准备：试剂、仪器及实验用具等,）确定供试品的内毒素限值（）,）选择鲎试剂（）,）计算供试品的最大有效稀释（）或最低有效浓度（）,）鲎试剂灵敏度复核,）供试品干扰初筛试验（建议试验）,）供试品干扰验证试验,）供试品日常检查,2007-9-10,29,、试验器具,）器具的要求及处理玻璃器皿需除热原处理，以除去可能存在的外源性内毒素，常用方法是玻璃器皿经清洗后至少干烤小时,塑料器械应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械,首选硼硅酸盐玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具,）孵育反应仪器,温度精确： ,发热均匀： ,可定时提示：至分钟可设定定时蜂鸣提示,试管免封口,2007-9-10,30,、鲎试剂灵敏度复核试验,）鲎试剂灵敏度复核实验目的）验证实验室的条件是否满足实验的要求）验证实验人员的操作技能是否满足实验的要求,）验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、用水等）是否满足实验的要求,）鲎试剂灵敏度复核实验的步骤）恒温仪器预热）溶液（标准内毒素溶液）的制备）鲎试剂制备）加样及恒温反应）结果判断）数据处理,2007-9-10,31,稀释为、内毒素标准溶液,溶液反应：()，平行管,溶液反应：水，平行管,单次管：原安瓿,多次管：反应试管,轻轻转动瓶壁摇匀,每步稀释于旋涡混合器混合,旋涡混合器混合,混匀,混合,水复溶,水复溶,或,鲎试剂,，,混匀（水浴恒温需封口）,）操作步骤示意图,2007-9-10,32,）灵敏度复核试验举例,() 试剂,试剂名称,厂 家,规格,标示效价,数 量,安度斯,支,内毒素标准品,安度斯,瓶,水,安度斯,瓶,2007-9-10,33,（）实验前，将恒温仪器预热至,（）标准内毒素溶液（溶液）的制备,0.25EU/ml,30s,30s,1EU/ml,30s,5min,2.0ml,100EU/ml,0.4ml,CSE,BET,水,1.0ml,10EU/ml,0.4ml,3.6ml,0.5EU/ml,2.0ml,3.6ml,2.0ml,2.0ml,0.125EU/ml,30s,2.0ml,2.0ml,0.06EU/ml,30s,2.0ml,2.0ml,2007-9-10,34,（）鲎试剂的准备取装量，灵敏度为的鲎试剂支，在安瓿颈部折断，按照阴性对照溶液两支，标准内毒素溶液每浓度平行管排列：,用精确移液器准确吸取水分别加入每支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解,阴性对照溶液,2007-9-10,35,CSE,TAL,0.1ml,0.5EU/ml,0.1ml,0.1ml,0.25EU/ml,0.1ml,0.1ml,0.125EU/ml,0.1ml,0.1ml,0.06EU/ml,0.1ml,0.1ml,NC,0.1ml,（）加 样,用精确移液器分别吸取的、 、 、的标准内毒素溶液，加入已复溶的鲎试剂中，每平行管，吸取用水（溶液）加入另外两支鲎试剂内，作为阴性对照。,加样顺序一般从低浓度到高浓度,2007-9-10,36,（）恒温反应,将加样完的混合液轻轻摇匀（避免产生气泡），放入 的恒温器中孵育分钟（孵育过程中避免振动影响凝胶形成）,若保温装置是水浴恒温箱，那么在加样后需将反应管封口，避免水蒸气进入反应管内造成污染。的混合液需封口后再将其放入水浴中恒温反应,2007-9-10,37,（）结果判断将反应试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为“”；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为“”。, , ,阳性,阴性,结果判断：反应管缓缓倒转,阳性()：凝胶不变形，不从管壁滑脱者,阴性()：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者,实验符合要求的基本条件：,管全部阴性 （）,管全部阳性 （）,管全部阴性 （）,2007-9-10,38,（）数据处理, （）,()()(. )(. ),即在本批号鲎试剂的复核灵敏度（ ）为,药典要求：在 （包括和）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度值。,结论：本批的灵敏度标示值符合规定，按标示值使用!,平行,管,C溶液(EU/ml),D溶液,反应终点浓度,X,（lg反应终点浓度）,0.5,0.25,0.125,0.06,1,0.125,0.903,2,0.25,0. 602,3,0.25,0. 602,4,0.25,0. 602,2007-9-10,39,、干扰初筛试验,）目的及原理：,本试验是药品与鲎试剂相容性的筛选试验，通过对一系列含内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应，初步筛选出对鲎试验无干扰的浓度。,本试验可减少干扰试验的盲目性,）试验步骤,供试品限值的确定,供试品最大有效稀释倍数的确定,试剂的选择,反应溶液的制备,加样及反应,结果判断,2007-9-10,40,（）供试品限值,硫酸庆大霉素，瓶，；,药典要求，硫酸庆大霉素限值,（）最大有效稀释倍数的确定,最大有效稀释倍数；,使用灵敏度的鲎试剂时，, 倍,由此可计算出使用不同时所对应的:,) 干扰初筛试验举例,2007-9-10,41,灵敏度（）,对应的(倍),由此可计算出使用不同时所对应的:,（）试剂,试剂名称,厂 家,规格,标示效价,数 量,安度斯,支,内毒素标准品,安度斯,瓶,水,安度斯,瓶,2007-9-10,42,（）各反应溶液的制备,溶液编号,溶液内容,平,行,管,溶液编号,溶液内容, ,平,行,管,2007-9-10,43,溶液的制备,溶液的制备,原液,溶液: ,溶液,2007-9-10,44,溶液的制备,注意事项：制备溶液和时，每一步的混合液需在旋涡混合器上混合至少秒,2007-9-10,45,（）加样及反应,用移液器准确吸取水将鲎试剂复溶,取相应溶液、加入鲎试剂反应管，每浓度平行管,另外取水作为阴性对照溶液加入鲎试剂反应管,2007-9-10,46,（）结果判断,溶液编号,溶液内容,平,行,管,溶液编号,溶液内容, ,平,行,管,2007-9-10,47,当溶液、均为阴性；溶液均为阳性时，试验有效。,溶液系列中，第一个出现阳性结果的浓度即初步将其判断为样品的无干扰浓度。本试验中的样品无干扰浓度为,2007-9-10,48,、干扰试验,通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对检查有干扰。,至少对批样品进行干扰试验。,）试验步骤：,供试品限值的确定。,鲎试剂的选择,最大有效稀释倍数的确定,反应溶液的制备,加样及反应,结果判断,2007-9-10,49,何种情况下要做干扰试验？ 干扰试验是一个验证实验,新品种建立方法,鲎试剂的来源改变,鲎试剂的配方、生产工艺改变,供试品的来源改变,供试品的配方、生产工艺改变,试验环境中发生了其它任何有可能影响试验结果的变化,2007-9-10,50,（）供试品限值,硫酸庆大霉素，；,药典要求内毒素限值,（）试剂选择,试剂名称,厂 家,规格,标示效价,数 量,安度斯,支,内毒素标准品,安度斯,瓶,（）,水,安度斯,瓶,2007-9-10,51,根据干扰初筛试验的结果，供试品在倍稀释（对应鲎试剂灵敏度为）时无干扰。,一般不选择第一个出现阳性结果的供试品浓度作干扰试验。本试验我们选择灵敏度为的鲎试剂进行干扰验证试验。,（）最大有效稀释倍数的计算, （倍）, (倍),2007-9-10,52,（）各反应溶液的制备,溶液编号,溶液内容,平,行,管,溶液编号,溶液内容,平,行,管,2007-9-10,53,溶液的制备,0.25EU/ml,30s,30s,1EU/ml,30s,5min,1.8ml,100EU/ml,0.4ml,CSE,BET,水,1.0ml,10EU/ml,0.4ml,3.6ml,0.5EU/ml,1.8ml,3.6ml,1.8ml,1.8ml,0.125EU/ml,30s,1.8ml,1.8ml,0.06EU/ml,30s,1.8ml,1.8ml,2007-9-10,54,溶液的制备（供试品的稀释）,硫酸庆大霉素注射液,0.3ml,20000U/ml,0.6ml,1.0ml,BET,水,3.0ml,2.7ml,1:10,1:40,0.6ml,1:80,S10,S40,S80,2007-9-10,55,溶液的制备,2007-9-10,56,（）加样及反应,（）,（）,（）,（）,水,（）,（）,（）,（）,2007-9-10,57,支鲎试剂，先用复溶，再加相应的溶液, 反应 分钟,（）结果判断,2007-9-10,58,反应结果,溶液编号,溶液内容,平,行,管,溶液编号,溶液内容,平,行,管,2007-9-10,59,结果计算及判断,（）,（）,、分别为系列和的反应终点浓度的几何平均值。,、分别为系列和的反应终点浓度的对数值（）。,(),()(),2007-9-10,60,结论：使用灵敏度的鲎试剂对样品（）的倍稀释液（）作，无干扰。,当溶液和溶液（阴性对照）的所有平行管都为阴性，且 时，试验有效。,当 时，供试品在该浓度下对检查无干扰。,本试验： ， ,， ，有效, ，,， ，无干扰,药典规定：,2007-9-10,61,、 检查法 ）凝胶法限量试验,（）反应设置：,溶液编号,溶液内容,平,行,管,2007-9-10,62,（）试剂选择,试剂名称,厂 家,规格,标示效价,数 量,安度斯,支,内毒素标准品,安度斯,瓶,水,安度斯,瓶,硫酸庆大霉素(),支,根据干扰试验结果，供试品在倍稀释，使用鲎试剂灵敏度为条件下，对无干扰,本试验选择灵敏度为,供试品稀释倍检查,2007-9-10,63,溶液的制备,溶液的制备,原液,溶液的制备,溶液,溶液,溶液,()各反应溶液制备,2007-9-10,64,反应项目,每管加样内容,管数,溶液,溶液,溶液,水,（）加样及反应,试管封口 混合 孵育（ 分钟）,支鲎试剂，先加水复溶，再加入相应溶液（如图）,2007-9-10,65,溶液编号内容,（）,（）,（）,合格,不合格,需复检,复检合格,复检不合格,试验无效,试验无效,试验无效,()结果判断,2007-9-10,66,举例：注射用头孢拉定的内毒素日常检查,试剂名称,厂 家,剂型,复溶体积或装 量,标示灵敏度() 或效价,数量（支）,安度斯,冻干品,支,中检所,冻干品,支,支,水,安度斯,支,注射用头孢拉定,注射用无菌粉末,支,2007-9-10,67,） 参数确定:, 供试品的内毒素限值：,中国药典上规定注射用头孢拉定的内毒素限值为。, 鲎试剂灵敏度的选择,根据干扰试验的结果，可选择灵敏度为的对注射用头孢拉定按最大有效稀释倍数()进行日常检查。, 计算:加 水溶解一支供试品,得浓度的供试液。,2007-9-10,68,） 制备供试液:, 供试品溶液（）的制备,头孢拉定,水,2007-9-10,69, 内毒素溶液（）的制备,0.25EU/ml,30s,30s,15min,20EU/ml,0.4ml,CSE,BET,水,1.0ml,2.0EU/ml,0.5EU/ml,1.0ml,1.0ml,3.0ml,1.0ml,3.6ml,E,0.5,E,0.25,2007-9-10,70, 含内毒素的供试液（）的制备,（ ）,（）,注射用头孢拉定稀释液,2007-9-10,71, 加样反应,反应项目,每管加样内容,管数,溶液,溶液,溶液,水,试管封口 混合 孵育（分钟）,2007-9-10,72,. 凝胶法半定量试验 应用举例,2007-9-10,73,. 供试品及试剂,供试品():葡萄糖氯化钠注射液， 内毒素限值,：,检查用水（）,2007-9-10,74,. 凝胶半定量试验溶液的制备,编号,内毒素浓度加入内毒素的溶液,稀释用液,稀释倍数,所含内毒素的浓度,平行管数,无供试品溶液,检查用水,供试品溶液,检查用水,检查用水,无检查用水,注：为不超过并且通过干扰实验的供试品溶液，从通过干扰试验的稀释倍数 开始用检查用水稀释成倍，倍，倍，倍，最后的稀释倍数不得超过。 为浓度标准内毒素的溶液（供试品阳性对照） 为鲎试剂标示灵敏度的对照系列 为阴性对照,2007-9-10,75,. 溶液的制备,用复溶,用把稀释成如下系列浓度溶液：, , , 可以分步稀释： 也可以一步稀释：,*注意：稀释须按规定漩涡混合溶液。,2007-9-10,76,. 溶液的制备,假设样品（）的原液（）已经过干扰试验验证是无干扰；,计算:,用把稀释成如下系列浓度溶液： ，,(),2007-9-10,77,. 溶液的制备,由于是原液，要添加浓度的到，只能采用近似法；,用把稀释至（最好在制备溶液时一起制备）；,2007-9-10,78,. 反应试管设置及加样反应,(检查管),(),(灵敏度验证),(),平行管,每管分别加 ，再加对应溶液，摇匀置孵育分钟后观察凝胶结果。,2007-9-10,79,. 结果判断与计算,试验有效的条件：*项：*项：*项：且 （即 ）,2007-9-10,80,假设反应结果如下表，计算样品()的内毒素含量：,(检查管),(),(灵敏度验证),(),平行管,2007-9-10,81,）根据的条件判断，此试验有效。,）样品的内毒素含量第系列反应终点浓度： (倍)第系列反应终点浓度： (倍) 即样品()的内毒素浓度为。,2007-9-10,82,年版中国药典的“细菌内毒素检查法”中包含种方法：,方法一：凝胶法（限量及半定量检测法）,方法二：光度测定法（定量检测法）,. 光度测定法鲎试验,2007-9-10,83,光度测定法的原理,光度测定法是利用鲎试剂与内毒素的混合物在反应过程的透光度变化与内毒素量的关系来定量检测内毒素的一种方法。光度测定的原理示意图如下：,当一束光线进入如下光电转换装置时，该装置将产生电流，我们称为透光强度。,入射光,反应混合物,透射光,光电池,I,透光容器,2007-9-10,84,设：初始透光强度为I,s，,某时刻透光强度为I,t,定义1：,透光度,（R,t,）,： *初始时It=Is，R,t,=100%，R,t,=100%，R,t,曲线变化趋势由高至低。,定义2：,吸光度,(OD),：,*初始时I,t,=I,s,，OD=0，OD曲线变化趋势由低至升高。,I,s,I,t,I,e,T(分),I,2007-9-10,85,Bitab,