DEAE纤维素离子交换层析法分离血清蛋白

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物化学实验,DEAE,纤维素离子交换层析法分离血清蛋白,指导教师：曹文华,1,实验目的,掌握,DEAE-,纤维素离子交换层析法分离血清蛋白质的实验原理及过程。,（参见教材,P94-95,实验十六,）,熟悉层析技术的相关原理。,（,参见教材,P12-23,：包括层析技术的概念、分类及分离原理。离子交换层析法的基本原理、介质种类、洗脱方式等。整套层析设备的组成及使用等）,2,层析的基本原理及分类,离子交换层析法,本实验的分离原理,实验原理,3,层 析,是利用混合物中各组分的,物理化学性质,的差别，使各组分在,两个相,中的分布不同，而使各组分可以不同速度随流动相向前移动而达到分离的目的,如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等,固定相,流动相,4,固定相：固定相是层析的一个基质。,固体物质：如吸附剂，凝胶，离子交换剂等,液体物质：如固定在硅胶或纤维素上的溶液,这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。,流动相：推动固定相上待分离的物质朝着一个,方向移动的液体、气体等。,柱层析,-,洗脱剂,薄层层析,-,展层剂,5,introduction,A representation of the principles of chromatography,mobile phase,Stationary phase,6,返回,根据层析分离机制,柱层析,薄层层析,纸层析,吸附层析,分配层析,离子交换层析,凝胶层析,亲和层析,气相,(,气,-,液,;,气,-,固,),层析,液相,(,液,-,液,;,液,-,固,),层析,根据两相所处状态,根据操作形式不同,层析分类,7,离子交换层析法,是分析性和制备性的分离、纯化混合物的液,-,固相层析方法。,它基于所研究或所分离物质的阳或阴离子和,相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据,物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸,附和脱吸附而将溶液的各组分分开。,固定相就是,离子交换剂,，流动相是具有一定,pH,值和离子强度的电解质溶液。,8,离子交换剂,：是一类含有可解离基团的不溶性的高,分子化合物。,根据交换剂的结构不同，分为,离子交换树脂,分类 离子交换纤维素,离子交换葡聚糖和离子交换琼脂凝胶,根据交换剂的性能不同，分为,阳离子交换剂,阴离子交换剂,*,9,10,11,本实验分离原理,本实验是用离子交换层析的分离原理，将血清蛋白质（白蛋白,PI=4.88(4.7-4.9); 1,球蛋白,PI=1,球蛋白,PI = 5.06; ,球蛋白,PI=5.12; ,球蛋白,PI=6.85-7.50,）在,pH,为,8,的条件下交换到装在柱子中的,DEAE,纤维素离子交换剂（阴离子交换剂）上后，应用梯度洗脱法，逐渐改变,pH,与离子强度，将血清中各种蛋白质组成成分逐步洗脱下来，从而达到分离提纯的目的。,12,各血浆蛋白质的等电点,清蛋白,1-,球蛋白,2-,球蛋白,-,球蛋白,-,球蛋白,分类,pI,pH8.0,组成比例,56,一,62,4,一,7,9,一,11,11,一,15,12,一,16%,4.64,5.06,5.06,5.12,6.85-7.3,13,纤维素的处理,仪器连接与装柱,上样与洗脱,实验操作,14,转型,膨润,一、纤维素的处理,平衡,DEAE-,纤维素,6g,混匀后静置,30,分钟,充分洗涤至,PH4,0.5M NaOH 50 ml,0.5M HCl 50 ml,充分洗涤至,PH8,0.01 M Na,2,HPO,4,100 ml,反复平衡至,PH = 8,混匀后静置,30,分钟,实验操作,15,膨润的作用,1,、使层析介质形成其特定功能基团,2,、加大纤维素之间的距离，以利于蛋白质的通过,3,、清除杂质,16,转型或再生的作用,1,、用置换能力强、浓度高的离子将层析介质所结合的离子置换下来,2,、清除杂质,17,平衡的作用,1,、用交换能力弱的离子取代交换能力强的离子，有利于蛋白质的置换并防止蛋白质的变性,2,、设定起始的离子强度和,PH,值,18,二、仪器的连接与装柱,实验操作,19,装柱前,注意事项,一定要检查柱子两端是否流通，确保柱子不堵。,然后组装好层析柱，并连接好恒流泵、紫外检测仪、及记录仪。,在紫外检测仪的出口端放一只烧杯接流出液。,20,装 柱,层析柱下口旋紧、层析柱上口打开,从上口倒入液体,上口倒入纤维素,起始洗脱液，排气、查漏,已平衡好的纤维素,纤维素沉降完全,纤维素,1/22/3,高度,保留弯月形液体界面,封闭良好、防漏,流出管口封闭,21,装柱,注意事项,将处理好的纤维素悬液倾入层析柱内 （注意不要带入气泡，如混悬液过浓，可增加适量,Na2HPO4,液）,打开恒流泵，使液体流出，,控制流速为,3-6,秒,1,滴,。直到全部纤维素都放入柱内（或柱中纤维素沉积至一定高度）,注意：,一定不要干柱,22,装柱后期,再次检查整套层析设备是否正确连接,调好检测零点及流速：以,0.01mol/L Na2HPO4,为标准调基线（吸光度,A,为,5%,， 透光率,T,为,95%,）；流速为,5-10,滴每分钟,(6-12,秒,1,滴,),。,记录仪：摘下笔帽，笔落下，启动，测量状态，走纸速度为,6cm/h,量程为,100mV,23,三、加样,当液面接近纤维素顶上界面（注意：一定不要干柱），关闭恒流泵。用吸量管小心在层析管内接近纤维素层处缓慢加入血清,0.5mL,（注意不要搅拌纤维素界面）。,打开恒流泵，使液体缓慢流出（,5-10,滴分钟），到全部血清刚好流入纤维素层界面，立即再用滴管小心加入,1mL 0.01mol/L Na2HPO4,液，直到液面接近纤维素层界面时，关闭恒流泵。,实验操作,24,上 样,加入血清,0.5 ml,待样品完全进入,加入起始洗脱液,洗脱液高约,1,厘米,层析柱上口旋紧,流出管口封闭,25,加样前液面相切,加样：,0.5ml,血清,样品流入,纤维素,加入,1mL,Na2HPO4,液,流入,纤维素,液面相切,26,四、洗脱,（,1,）用,1,倍柱床体积（,10-15ml,）的起始缓冲液洗涤未交换的蛋白质,。,可利用梯度发生装置洗脱：,将梯度发生器的两个盛液杯间的及出口处的螺旋夹拧紧，在有出口一侧加入,30mL 0.01mol/L Na2HPO4,液（放转子），另一侧加,30mL 0.5mol/L NaH2PO4,液。排气泡后，将梯度发生器放到磁力搅拌器上（放在比层析柱高约,30-50cm,处）。将连接梯度发生器出口的细橡皮管连到层析柱顶橡皮塞上的连接管上，使液体流入柱内（注意不要漏气）,27,量取,10-15ml Na2HPO4,液补加至梯度发生器的相应的盛液杯中。,将梯度发生器的两个盛液杯间出口处的螺旋夹拧松，流速为,5-10,滴每分钟,(6-12,秒,1,滴,),进行洗脱直至两盛液杯液面高度一致，,28,（,2,）,PH,梯度洗脱：,两盛液杯液面高度达到一致时，将梯度发生器的两个盛液杯间的螺旋夹拧松，开动磁力搅拌器，速度不要快，（避免将空气卷入液体内）,打开层析柱下端的恒流泵，控制液体流速为,10,滴分钟,(6,秒,/,滴,),，观察记录仪上的结果。,29,上样参数：,0.5 ml,血清,洗脱参数：,起始缓冲液：,30 ml 0.01M Na,2,HPO,4,终末缓冲液：,30 ml 0.5 M NaH,2,PO,4,洗脱速度：,8,滴,/,分钟,记录仪器参数：,电压：,100 mV,走纸速度：,6 cm/h,层析参数,30,当梯度发生器的两个盛液杯中的液体流尽时，停止洗脱。,用,100ml,蒸馏水,冲洗紫外检测仪的样品池后，关闭恒流泵、紫外检测仪、及记录仪的开关。,抬笔，戴上笔帽。回收,DEAE,纤维素,（千万不要倒掉！），浸泡在蒸馏水中留供以后实验用。,清洗玻璃仪器，整理实验台。,洗脱结束后,31,记录实验流程,分析实验结果,书写实验报告,实验结果与结果分析,32,上样参数：,0.5 ml,血清,洗脱参数：,起始缓冲液：,30 ml 0.01M Na,2,HPO,4,终末缓冲液：,30 ml 0.5 M NaH,2,PO,4,洗脱速度：,8,滴,/,分钟,记录仪器参数：,电压：,100 mV,走纸速度：,6 cm/h,层析参数,33,影响离子交换层析分离效果的因素：,离子强度,洗脱速度,34,35,36,37,38,39,