免疫组化1概论抗原抗体

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免 疫 组 化,Immunohistochemistry,1,学习本章节的总体要求,*,1.,熟悉免疫组织化学技术特点,及其原理,*,2.,掌握免疫组织化学染色的操作流 程,*,3.,熟悉免疫化学反应相关术语及其所用免疫试剂的来源和质量控制,4.,了解多克隆抗体制备程序与操作要求,5.,了解单克隆抗体制备原理和步骤,2,概 论,一、什么是免疫组织化学,免疫组织化学是应用免疫学和组织化学原理，对细胞组织标本中的某些多肽、蛋白质等大分子物质进行,定性、定位、定量研究,的,一门科学。,3,这项技术本质上是一种,染色及原,位示踪技术,，,它是在,酶组织化学,基础,上发展起来的，始于,20,世纪中期,。,二、发展历史,4,免疫荧光标记抗体技术,-Coons 1940,年免疫酶标抗体技术,-Abakane 1963,不标记酶抗体（酶抗酶复合物）技术,-Sternberger 1970,胶体金免疫标记技术和亲和标记技术,-Hsu 1985,5,免疫试剂,，,自,1975,年,Kohler,和,Milstein,发明了单克隆抗体制备的,杂交瘤技术,后，已从采用多克隆抗体转入了广泛应用单克隆抗体时代。目前商品供应的特异性第一抗体和交联第二抗体，绝大多数都为,单克隆抗体,。,6,1.,特异性强 专一,2.,敏感性高 检测阈值达,ng,或,pg,水平,3.,定位准确 既可定性、定位，又可定量,4.,三位一体 形态、功能和代谢三结合,缺点：,干扰多，易出现,假阳性,三、技术特点（优点）,7,（一）,组织处理与切片选择,（二）免疫染色的前处理,试剂准备（示踪，放大，标记）,消化,阻断,*（三）免疫组化染色,原理、优缺点、流程,（四）免疫染色的后处理,增强、衬染、封固,四、,免疫组织化学染色操作步骤,8,*,（五）结果判断与对照设置,方法众多,敏感不同,程序雷同,按需选用,关键步骤：,特异抗体,-,桥联抗体,-,标记抗体,种系必需匹配,（第一抗体）（第二抗体）（第三抗体）,9,第一节 抗原和抗体,10,一、,抗原,：,凡能刺激机体产生特异性免疫应答（,免疫原性,），并能与相应免疫应答物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内、外发生特异性结合（,反应原性,）的物质。,抗原的免疫原性,取决于抗原的,异物性,；,大分子,；,表面积,；,专一决定簇,等,。,11,半抗原载体蛋白 全抗原,载体蛋白：,BSA,、 多聚赖氨酸 、 牛甲状腺球蛋白等；,（免疫原性强，易获得，交叉反应易去除）,交联要求：,不改变半抗原的分子构型；,远离半抗原的抗原决定簇；,高结合率（结合半抗原数目至少,20,个以上）,交联剂,12,抗原决定簇,(,表位,),：,抗原分子中决,定,抗原特异性的活性,化学基团,，其性,质、数量、空间构型决定抗原的特异性。,-,免疫组化的,精确性、特异性,13,交叉反应：,抗原（或抗体）除与其相应抗体（或抗原）特异结合外，有时可与其他抗体（或抗原）发生反应。,-,多数天然抗原表面带有多个相同或不同的表位,-,不同抗原的表位相同或相似的情况下可发生交叉反应,-,免疫组化的,假阳性,14,二、抗体,B,细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白，又称免疫球蛋白（,immunoglobulin,，,Ig,）。,-,可与相应抗原特异性结合,-,亦可作为抗原，激发免疫应答,15,抗体的分子结构,1.,抗体分子在立体构型上都是,Ig,， 但,Ig,不都是抗体。,2.,各类,Ig,的基本单位都是四条肽链的对称结构,包括二条相同的,重链,(heavy chain, H,链,),及二条相同的,轻链,(light chain,L,链,),每条重链,(H,链,),和轻链,(L,链,),分为氨基端,(N,端,),和羧基端,(C,端,),。,16,3,.,两条重链间，两条轻链间及重链和轻链间，分别借,二硫键,连接。此为免疫球蛋白的基本结构，又称为免疫球蛋白的单体,呈,“,Y,”,字构型,。,17,4.,重链上结合有不同量的糖,故,Ig,属糖蛋白。根据重链抗原性的不同可分为,5,类，即,链，,链，,链，,链和,链， 由它们组成的,Ig,分别称为,IgM,，,IgG,，,IgA,，,IgE,和,IgD,。,18,5.,轻链也可根据其化学结构和抗原性的差异分为,和,二型。一个,Ig,分子的二条轻链型别相同，绝无可能,型和,型共同存在于同一个,Ig,分子中。,19,6. Ig,单体的氨基酸序列可分为,恒定区,（,constant region,C,区,),和,可变区,（,variable region,V,区）。,-,可变区,位于,Ig,多肽链的,N,端，占轻链的约,1/2,及重链的约,1/4,（,Ig,结合抗原的所在部位,）,-,恒定区,位于,Ig,多肽链的,C,端，占轻链的余下的,1/2,及重链的,3/4,（,补体结合域，,Fc,受体结合位点，,Ig,抗原决定簇等所在部位,）,20,7. Ig,的水解片断可因选用的水解酶不同而异。采用,木瓜蛋白酶,(papain),水解,Ig,时：,-2,个相同的,Fab,(fragment antigen binding),段，即抗原结合片断,-1,个,Fc,（,fragment crystalliable),段，即可结晶片断，拥有,Ig,抗原决定簇。,21,采用胃蛋白酶（,pepsin,），其酶切位点在,Ig,重链间二硫键近羧基端,-,一个具双价抗体活性的,F(ab),2,片断,-,一个不具任何免疫活性的,Fc,片断。,22,8.,抗体的蛋白类型主要为,IgG,和,IgM,。,-IgM,见于初次免疫和免疫早期，滞留时间较短。,-IgG,一般见于加强免疫和免疫晚期，滞留时间较长，是免疫球蛋白的主要类型。,23,三、抗体的制备,依制备途径，目前人工制备的特异性抗体有三类：,-,多克隆抗体（,PcAb,）,-,单克隆抗体（,McAb,）,-,基因工程抗体,24,（一）,抗原提取与纯化的一般原则,1.,建立检测方法,（定性、定量、活性）,2.,选择,抗原含量高、易获得、价廉、可大量收集的样品为,原料,-,人,AFPAFP(+),肝癌病人腹水；,4,6,月胎儿血清,-,鼠,AFP,孕,18,天大鼠羊水,-,波形蛋白（,vimentin,）,猪、牛眼晶状体,-,角蛋白（,keratin,）,角化上皮,-,肌红蛋白（,myoglobin,）,骨骼肌,-,胶原（,collagen,）,皮肤、肌腱等,25,3.,保持抗原分子的稳定性,-,低温、适度,pH,与离子强度、抑制酶解、保护巯基,4.,操作步骤简易、有效,。,-,提取,-,分离纯化,-,浓缩,-,贮存,26,（二）多克隆抗体（抗血清）,PcAb,的 制备程序,多克隆抗体,-,指由不同克隆,B,细胞产生的抗体混合物,。,-,每种抗原有多个表位,-,用其免疫动物会产生针对各表位的不同抗体（多克隆抗体）,-,血清中的抗体皆是多克隆的,优点：,制备简便、价格低廉、抗体效价高,缺点：,特异性不高、易发交叉反应、效价不太稳定,27,（二）多克隆抗体（抗血清）,PcAb,的 制备程序,1,抗原纯化,免疫原,2,免疫动物,免疫对象,3,收集抗血清,粗、混合品,4,提取,IgG,PcAb,，纯品,5,质量鉴定,效价、特异性、蛋白量,6,保存与使用,免疫试剂,纯度（杂纯）：抗血清,r,球蛋白,IgG,特异性,IgGIgG,片段（,Fab,或,F(ab,),2,）,抗体,IgG,28,（三）单克隆抗体的制备及其应用,单克隆抗体是指由单个克隆的,杂交瘤细胞,产生针对,一种抗原决定簇,的特异性抗体,。它是采用,B,淋巴细胞杂交瘤技术（抗体的细胞工程）制备的。,优点：,纯度高、特异性强、交叉反应少、质量和效价稳定,缺点：,制备复杂、价格昂贵、抗体效价较低,29,1 .,利用杂交瘤技术制备,McAb,的基本原理,-,淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一个,B,细胞克隆只产生一种抗体；,-,细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性；,-,利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的,McAb,。,30,2. McAb,的制备流程,亲本细胞准备细胞杂交融合（,PEG,）,HAT,选择性培养杂交瘤细胞克隆性培养与建株（有效稀释法）大量制备单克隆抗体质量鉴定与分装冻存,（扩大培养或接种动物）,（杂交瘤细胞冻存与复苏）,31,抗原免疫,免疫脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞,(BALB/C,小鼠,),（经,8-AG,或,6-TG,诱导）,(,亲本细胞,),混合、融合（,PEG,）,选择性培养（,HAT,）,筛选和克隆化,冻存 阳性细胞建株（稳定分泌,McAb,）,（杂交瘤细胞）,复苏,McAb,大量制备（上清或腹水,-,鼠）,稳定性检查 纯化、鉴定（特异性、活性、含量）,2. McAb,的制备流程,32,四、抗体的标记,-,荧光素,-,酶,-,胶体金、胶体铁,33,