一++菌种与种子扩大培养

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第一章 菌种与种子扩大培养,重点,：微生物工业对菌种的要求；生产用菌 种的保藏及选育；防止菌种衰退的措施,难点,：工业微生物的培养类型,1,第一节 微生物工业用菌种,一、微生物工业对菌种的要求,培养基原料来源广、廉价；,培养条件易控制；,对于微生物的生长往往存在一个“,临界溶氧浓度,”，低于这个溶氧浓度，氧就成了微生物生长的限制性因子。,pH值:中性偏酸性，偏碱性，强烈的pH值易改变产物和底物的状态。,温度：最低、最高、最适生长温度，低温菌，耐高温菌种。,渗透压：等渗,2,发酵周期短；,菌株高产；对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细胞不易发生菌体自溶。,对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎；,对于基因工程菌，通常目的产物存在于包含体内，对于包含体，要求在细胞破碎时不易破碎，而在目的产物的分离提取时，则易破碎。,抗病毒（噬菌体）能力强；,菌株性状稳定，不易变异退化；,菌体本身不能是病原菌；,二、工业常用的微生物,3,从微生物分类学的角度，分为：,细菌类：,短杆菌：氨基酸发酵（谷氨酸）,枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白,酶等,地衣芽孢杆菌：耐高温-淀粉酶),苏云金芽孢杆菌：BT生物农药,梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等发酵,酵母菌：,啤酒酵母：酿酒酵母、辅酶类物质的发酵,酒精酵母：酒精,汉逊酵母：食品工业，用于乙酸乙酯的发酵,假丝酵母：scp生产，石油发酵,4,霉菌：,黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、,酶制剂工业（糖化酶）,黄曲霉：酱油生产(3042)，面酱,青霉菌：青霉素的生产,红曲霉：红曲制造，用于南方红曲酒,（女儿红）的生产；使用红色色,素的生产；豆腐乳的生产等,赤霉菌：赤霉素的生产，是一种植物生,长激素,5,工业常用的微生物：,细菌,属 名,种 名,用 途,假单孢菌属,铜绿假单孢菌,谷氨酸、水杨酸、丙酮酸、蛋白酶,短小假单孢菌,赖氨酸,萤光假单孢菌,天冬氨酸、葡糖酸、2-酮基葡糖酸、,甲烷假单孢菌,甲烷、丙烷粘性糖类,麦氏假单孢菌,2-酮古洛糖酸,卵假单孢菌,葡糖酸、天冬氨酸,臭味假单孢菌,瓜氨酸,6,醋杆菌属,纹膜醋杆菌,醋酸、丙酸、丁酸、葡糖酸、山梨醇,黑色醋杆菌,2，5-二酮基葡糖酸,奥尔兰醋杆菌,啤酒、醋酸,氧化醋杆菌,酒类,巴氏醋杆菌,醋酸、山梨糖,恶臭醋杆菌,醋、山梨糖、二羟基丙酮,弱氧化醋杆菌,5-酮基葡糖酸、丙酮酸、山梨糖,拟胶醋杆菌,丙酮酸、山梨糖、纤维素,埃希氏菌属,大肠杆菌,赖氨酸、苏氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸、,天冬氨酸、高丝氨酸、谷氨酸脱羧酶、酰胺酶、,天冬酰氨酶、丙酮酸、酮戊二酸，腺苷酸、大肠菌素,7,工业常用的微生物：,放线菌,属 名,种 名,用 途,诺卡氏菌属,珊瑚色诺卡氏菌,正烷烃2，2-二甲基粘康酸,小球诺卡氏菌,正烷烃谷氨酸,鼠白诺卡氏菌,利福霉素,暗色诺卡氏菌,单细胞蛋白,石蜡诺卡氏菌,正丁烷葡萄糖、糖醛酸,嗜石油诺卡氏菌,单细胞蛋白,东方诺卡氏菌,万古霉素,拟无枝酸菌属,地中海拟无枝酸菌,利福霉素,分枝杆菌属,黄色分枝杆菌,石油发酵,甲烷分枝扦菌,石蜡分枝杆菌,耻垢分技杆菌,结核分核杆菌,正构烷烃赖氨酸,8,工业常用的微生物：,霉菌,属 名,种 名,用 途,毛霉属,卷枝毛雹,脂肪,爪哇毛霉,蛋白酶、果胶酶、甾族化合物转化,东北毛霉,丙酮酸,高大毛霉,草酸、丁二酸、脂肪、甾族化合物转化,微小毛霉,丙氨酸、凝乳酶、蛋白酶、,甾族化合物转化,总状毛霉,丙氨酸、蛋白酶、3-羟基丁酮、,甾族化合物转化,鲁氏毛霉,淀粉酶、蛋白酶、丙二酸、乳酸、,丙酮酸,多刺毛霉,甾族化合物转化,9,三、生产菌种的保藏与选育,菌种保藏,（1）目的：,存活，不丢失，不污染；,防止优良性状丢失；,随时为生产、科研提供优良菌种。,（2）基本原理：根据菌种的生理生化特点，人工地创造,条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态。,（3）常用的菌种保藏方法：,斜面低温保藏法、甘油低温保藏法、砂土保藏法、麸皮保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温冻结法等。,10,几种常用菌种保藏方法的比较,方法名称,主要措施,适宜菌种,保藏期,评价,冰箱保藏法,（斜面）,液氮超低温保藏法,甘油低温封藏法,沙土保藏法,冷冻干燥法,低温,超低温,低温、缺氧,干燥、无营养,干燥、无氧、低温、有保护剂,各大类,各类,各大类,产孢子微生物,各大类,36月,长期,1年以上,110年,515年以上,简便,液氮,简便,简便有效,设备,11,12,划线培养后的细菌菌落,13,酿酒酵母,14,霉菌孢子,15,国内外菌种保藏机构：,菌种保藏机构的任务：,广泛收集科研和生产菌种、,菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、,不乱以及便于研究、交换和使用的目的。,菌种保藏机构：,中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM),美国的典型菌种保藏中心(ATCC),英国国家典型菌种保藏所（NCTC）,法国里昂巴斯德研究所（IPL）,工业微生物,农业微生物,16,四、菌种选育,（1）,目的：改善菌种的特性，使提高产量，改进质量，降低成本，改革工艺，方便管理及综合利用等。,（2）,方法：A、自然选育；B、抗噬菌体菌株选育；C、诱变育种；D、代谢控制育种；E、基因重组育种；,五、防止菌株衰退的措施,1、菌种退化：多次传代，发酵力、繁殖力下降；发酵产物得率低。,2、衰退的可能原因,菌种保藏不妥；,培养要求未得到满足；,17,3.防止菌种衰退的方法,尽可能满足其营养条件、培养条件，避免有害因素 影响；,尽量减少传代次数；,采用幼龄菌种；,4.菌种复壮方法,分离复壮（稀释平板法、平板划线法等）；,若单菌落分离不行，可改变培养条件，或两者结合进行复壮；,诱变因素处理，再进行单菌落分离；,18,第二节 种子扩大培养,一、种子扩大培养的任务,1.任务：每次发酵罐的投料，要提供相当数量代谢旺盛的种子。根据菌种生长速度快慢来决定扩大培养的级数；,2、三级发酵（50吨发酵罐）：,斜面一级摇床二级种子罐三级种子罐发酵罐,二、工业微生物的培养类型,静置培养法（厌气性发酵）；少，如酒精发酵,通气培养法（好气性发酵）；主要，如抗生素等,通气培养法作为种子扩大培养的具体方法：,液体培养法：三角瓶摇床震荡或回转式培养；,表面法培养：液体表层，菌体生长于表面；,19,固态法培养：固体培养基表面生长,大规模工业生产的培养方法及特点：,固体培养（曲法培养）,浅盘固体培养,深层固体培养,特点：酶活力高，但劳动强度大，曲层需翻动。,液体培养,浅盘液体培养：已不用，占地面积大,液体深层培养：几乎所有的好气培养都采用,特点：培养条件易控制，如温度，pH等，但易染菌，要求无菌。,20,载体培养：,吸收了固态的曲法培养与液态培 养的优点，是近年新发展的一种培养方法。,特点：固态基质做载体，发酵结束后将培养基及菌体挤压出来，载体可反复使用，如脲烷泡沫塑料块。,两步法液体深层培养：在酶制剂和氨基酸生产中应用较多。,特点：控制菌体生长条件与产酶条件区分开来，如先菌体生长，再改变条件产酶。,21,三、影响种子质量的主要因素,1.培养基,主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。,选用原则,：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。,对于种子用的培养基，摇瓶与种子罐用的培养基不相同，摇瓶要求培养基用的原材料精细，碳源浓度较低而且是用微生物较易利用的碳源；对于种子罐用培养基，要求使用接近大生产用的原材料，氮源浓度较高，有利于菌体的增殖。例如：HASS（高温淀粉酶）,三角瓶用碳源：葡萄糖+乳糖,3m3种子罐：液化淀粉,22,2、种龄与接种量：,种龄以对数期为宜；,接种量宜适当大；,接种量大的优缺点：,优点：缩短发酵周期；,减少染菌机会；,提高设备利用率,缺点：种子培养费时；,增加级数；,代谢废物多,23,3,.培养条件,温度：温度直接影响生长和酶的合成；,种子扩大培养的温度，从试管到三角瓶到种子罐，其温度也应逐步调整，最后接近大生产的温度，目的在于使菌种逐渐适应。,许多微生物其最适生长温度与最适发酵温度往往有差异的，例如：谷氨酸发酵，谷氨酸产生菌的最适合生长温度为：30，而产物合成温度为32-34,pH值：对微生物有明显的影响。,1）扩培选择的pH值是菌体的最适生长pH值。,2）培养基灭菌后，通常其pH值要下降0.51.0个单位,24,通气搅拌：（溶解氧的作用：参与菌体呼吸 作用）菌种扩大培养的目的就是提供大量的强壮的菌体，因此在扩培过程要求菌体增殖速度越快越好，增殖期消耗的底物葡萄糖越少越好，从这个意义上讲，扩培过程中应提供足够的氧气。,足够的溶氧取决于：搅拌转速、通气量、搅拌功率等,泡沫(危害：影响微生物对氧的吸收；妨碍CO2的排除；减少设备利用率),消泡方法：化学法（为主）、机械法,常用消泡剂：植物油，矿物油等,25,3,.染菌的控制,染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、无菌操作不严、菌种不纯；,4.种子罐级数：级数少则简单,种子罐级数的选择取决于：,种子的性质（生长繁殖性能）；,孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）；,孢子发芽及菌丝繁殖速度；,发酵罐中种子的最低接种量（一般10%）；,种子罐与发酵罐的容积比；,26,思考题,1、能源问题是全球面临的问题，生物工程将如何解决？,2、比较固体培养与液体培养的优缺点。,3、菌种扩大培养的目的和意义是什么？,4、工业生产用菌种的基本要求有什么？,5、种子罐级数的选择取决于那些因素？,6、简述加大接种量的优缺点。,7、简述防止菌种衰退的方法。,27,