RNA和DNA抽提

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,组织DNA提取和纯化,1,DNA的种类：,真核生物DNA,细菌DNA,病毒DNA,质粒DNA,95%以上是双链线性分子,形式多样：,单链环状,线状,双链环状,线状,双链环状,2,提取DNA样品的主要来源：,生物组织,血液,培养细胞,3,酚-氯仿抽提法（组织DNA）,碱变性法等（质粒DNA）；,实验方法,4,提取DNA的总原则,：,1、保证核酸一级结构的完整性；,2、排除,其它分子的污染,。,5,其它分子的污染:,(1),对酶有抑制作用的物质,有机溶剂、高浓度金属离子,(2),其他生物大分子,(降低到最低浓度),蛋白质、多糖和脂类,6,(3),其它核酸,的污染,提取DNA时，去除RNA,提取RNA时，去除DNA,7,尽量减少抽提过程中,各种影响因素对核酸的破坏,；,实验中的注意事项：,8,各种因素对核酸的破坏,：,物理因素,化学因素,生物因素,过酸或过碱的环境,机械剪切力和高温,各种核酸酶的降解,pH 410,EDTA等,操作轻柔,控制温度,9,实验目的,学习从生物组织中提取DNA为研究DNA的理化性质与结构功能打好基础。,10,基本步骤,DNP,DNA（RNA）,紫外定量,粉碎组织,裂解液,苯酚、氯仿,RNA酶、Protase ,乙醇,纯DNA,11,裂解液,（Homogenization buffer）:,试剂,1%SDS,10mmol/L pH8.0 Tris-HCl,1mmol/L EDTA,12,裂解细胞膜和核膜；,蛋白质变性沉淀,1%SDS （十二烷基磺酸钠）,是离子型表面活性剂,13,10mmol/L pH8.0 Tris-HCl,pH 57时,RNA比DNA更容易游离到水相中；,pH 8时,DNA比RNA更容易游离到水相,。,1mmol/L EDTA,抑制DNA酶活性,14,苯酚-氯仿,(Phenol-Chloroform):,蛋白变性剂(有机溶剂),蛋白质,变性,酚、氯仿变性蛋白质 H,2,0,分层,酚、氯仿,离心,DNA,15,H,2,O（DNA）,变性蛋白质,有机溶剂,16,酚的变性作用大于氯仿；,氯仿与水不互溶，不会带走DNA;,使用苯酚-氯仿,酚与水有一定程度互溶，大约10-15% 的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA；,酚与氯仿是互溶的，氯仿可以带走残余的酚。,17,因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中不再吸收样品中含有DNA的水分，以减少DNA 的损失。,苯酚用水饱和,：,18,氯仿-异戊醇,（Isoamyl-alcohol）：,异戊醇有助于分相，使离心后的分层维持稳定。,能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中泡沫的产生。,19,冰 无水乙醇,（Absolute alcohol）,低温条件下分子运动大大减少，DNA易于聚合沉淀。,乙醇与核酸不会引起任何化学反应，对DNA很安全；,极易溶于水，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失去水而易于聚合；,可除去残余的氯仿。,20,70%乙醇,(70% Ethonal)：,70%乙醇洗涤可去除残余的盐离子。,使DNA不易溶解,并可抑制酶活性,21,TE 缓冲液,（TE Buffer）：,10mmol/L pH8.0 Tris-HCl,1mmol/L EDTA,缓冲对Tris-HCl不存在金属离子的干扰作用,抑制DNA酶的活性,22,10mg/ml蛋白酶K,(Protase K)：,10mg/mlRNA酶,(RNase)：,分解蛋白质，破坏细胞膜,分解RNA,23,5mol/L NaCl,：,pH为8的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaCl使Na,+,中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子间的同性电荷相斥力。,易于聚合而形成DNA钠盐沉淀,24,仪器,操作,详见实验指导。,25,定量：,稀释,吸光度测定,（紫外分光光度计）,：,A,260 = ？,A,280 = ？,26,DNA纯度鉴定：,A,260,/A,280, 1.8, 1.6, 2.0,纯,酚或蛋白质污染,RNA污染,27,DNA浓度（g/ml）,= A,260nm, 50 稀释倍数 1/光径,DNA的吸收峰在260nm,1 OD相当于:,50 g/ml DNA,40 g/ml RNA,20 g/ml 寡核苷酸,28,DNA储存：,4或-20 存放于TE缓冲液中；,29,操作中的事项,1.处死动物取出所用脏器后应尽快放入液氮中,以免DNase引起DNA降解。在纯化过程中要加核酸酶抑制剂(eg.EDTA),以防DNA自身降解。,2.组织要尽量研磨得细一点，颗粒太大细胞裂解不彻底，在随后得保温过程中会导致DNA得严重降解。,30,3.真核细胞DNA分子量很大，机械张力极易引起DNA分子的断裂，因此操作条件要缓和，摇动速度不要过快，溶液转移次数要尽量减少。,4.由于酚腐蚀性较强，摇动抽提时应戴一次性手套。,31,组织总RNA的提取和纯化,(Purification and Isolation of Total RNA),32,核糖核酸,（ribonucleic acid,RNA）,RNA是在细胞核中，利用DNA作为模板合成的化学物质。在蛋白质合成中，几种不同形式的RNA起着重要作用。,33,RNA,的构成和种类,构成：,磷酸盐;核糖;碱基,34,种类：,messager RNA(mRNA,),-携带,DNA,的编码信息从细胞核到细胞质中，在那儿被用于蛋白质的合成,ribosomal RNA(rRNA),-核糖体中发现的一种,RNA,transfer RNA(tRNA,),-携带氨基酸到核糖体中以便它们能被连接在一起合成蛋白质,35,8085%,rRNA（主要是28S、18S、5S rRNA）,1015%,分子量不等的小分子RNA(tRNA、核内小分子RNA等）,15%,mRNA,36,RNA,是分子生物学研究的重要组成部分,cDNA,文库的构建,RNA,序列分析,RT-PCR,Northern Blotting,蛋白质的体外翻译,37,总,RNA,提取纯化的方法和原理,常用总,RNA,分离方法:,酸性异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法,(acid-guanidine-phenol-chloroform, AGPC),38,异硫氰酸胍,是已知作用最强的蛋白变性剂，在裂解细胞释放RNA的同时能迅速使RNA酶失活（酸性环境有利于其活性的发挥，能最大限度地发挥其对RNA酶的抑制作用）,39,十二烷基肌氨酸钠和酚,是强的蛋白变性剂，对,RNA,酶也有一定的抑制作用。,酸性环境下,RNA,、蛋白质和,DNA,分别进入不同的分布相中，,RNA,进入上层水相，蛋白质进入下层有机相，,DNA,则进入上下两层界面处的中间层。,40,氯仿,不但有一定的蛋白变性作用，而且能迅速使各相分离，使,RNA,与其它成分分开。,DEPC,配制的75%乙醇,洗涤（去除,RNA,表面的残留的有机溶剂）。,41,RNA,浓度,（g/ml）,=,A260nm,40,1,/光径稀释倍数,RNA,得量,（g）,=,RNA,浓度最终,RNA,原液毫升数,42,注意事项,1. 实验器具预处理和配制试剂的注意点:,a.,经清洗烘干的玻璃器皿，必须在,250,烘烤,4,小时，不能经受高温烘烤的塑料器具，最好只用一次。,b.,实验中要戴一次性手套。,c.RNA,抽提中所用的试剂均需用,DEPC,处理，但含,Tris,的试剂除外，因,DEPC,遇,Tris,迅速分解为乙醇和,CO2,。,43,2. 特异性,RNase,抑制剂的应用,钒酰核苷复合物,（VRC）,是一种氧化钒离子和四种核苷组成的复合物，可与,RNase,结合而抑制,RNase,的活性。常用浓度为,10mM,。,Rnasin,是一种从大鼠肝脏或人胎盘分离得到的分子量为,40000,的蛋白质，对,RNase,有抑制作用。,44,样品中的,VRC,和,Rnasin,都可用酚抽提方法去除。,焦碳酸二乙酯,DEPC,是,RNA,酶的强烈抑制剂。有致癌之嫌，须小心操作。,45,