一节克隆载体

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 克隆载体,1.,质粒载体（,plasimid vectors,）,2.,噬菌体载体（,phage vectors,）,3.,柯斯质粒载体（,cosmid vectors,）,4.,人工染色体载体（,B/Y/HAC,）,1,噬菌体简介,组成,：蛋白质、,核酸,.,结构：,蛋白质外壳,、,尾巴,尾巴上的,微丝,可以把噬菌体的,DNA,注入细菌内。,是比细菌还小得多的微生物，噬菌体侵犯细菌，可以认为它是细菌里的,“寄生虫”,。,Bacteriophage(phage),2,噬菌体或病毒的,DNA,能被开发成为基因工程的有用载体，因为：,1.,高效率的感染性,能使外源基因高效导入受体细胞；,2.,自主复制繁殖性能,使外源基因在受体细胞中高效扩增。,3,大肠杆菌的,-,噬菌体,（一）,-,噬菌体的生物学特性,1,、由外壳包装蛋白和,-DNA,组成,2,、,-,DNA,的物理图谱,（,1,）功能相近的基因在基因组中聚集在一起,目前已经被确定的基因至少,61,种，一半为必需基因,4,48.5kb,（,2,）线状双链,DNA,，两端各有一个,12,bp,的互补单链（,粘性末端，,cohesive,-end site,），称,cos,site,，粘性末端粘连接变成,环状,DNA,。,cos,位点是噬菌体包装必需序列。,5,噬菌体基因大致分为,3,个区：,功能区：裂解相关,S,和,R,，复制相关,O,和,P,非必须区：,非必须，基因重组,int,（,intagrate,）,及,xis,（,excision,）,结构区：,A,J19,个基因，编码,头、 尾部蛋白质,6,7,3,、感染周期（溶菌循环）,DNA,复制早期：一个,ori,，双向复制,晚期：滚环复制,-,多个,DNA,分子形成线状多联体,8,头部包装蛋白,首先结合在,cos,区,的附近，形成,包装启动复合物,，,A,蛋白,切割,cos,位点,。,包装,E,9,4,、溶源状态的建立,噬菌体感染大肠杆菌后，,DNA,直接,整合,到,宿主细胞染色体,DNA,上，并不裂解细胞，这种情况称为,溶源状态,。,DNA,重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。,整合主要由,cI,和,int,基因的产物所激活，这两个基因的开放,与关闭取决于宿主细胞本身的性质。,cI,基因：,编码阻遏蛋白，,是感染了,噬菌体的寄主细胞进,入溶源化的必要条件。,cI,基因失活或缺失,的,噬菌体无法,使寄主细胞,发生溶源化,效应。,10,噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体,DNA,上，成为,原噬菌体,。,适当条件下，原噬菌体又可以脱离寄主染色体，重新变成独立的复制子，这种过程叫做,原噬菌体的删除作用。,超感染免疫性,噬菌体,DNA,的整合与删除：,溶源性细菌，由于含有,原噬菌体,，故不能再,次被,同种,噬菌体感染。溶源性细菌所具有的这种,抗御,同种噬菌体再感染,的特性叫做,超感染免疫性,。,11,噬菌体的溶源和裂解,入侵,E.coli,后，可以按,裂解,或,建立溶原,两种生活方式生存和繁殖。,侵犯细菌时，只是,DNA,侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。,12,-,DNA,载体的构建,噬菌体的缺陷：,基因组太大（,48.5kb,）；,酶切点太多，它有,5,个,BamH1,位点（,GGATCC,），,6,个,Bg,位点（,AGATCT,），,5,个,EcoR,位点（,GAATTC,）。,野生型只能接纳一定长度的,DNA,。若相当于,噬菌体的,75-105%,，那么只能接纳,48.5kb5%=2.425kb,的,DNA,。,重组的,DNA,分子难于直接导入宿主细胞,利用体外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入,DNA,。,13,切去部分非必须的区域；,抹去多余的限制性内切酶切割位点；,插入可供选择的标记基因；,建立体外包装系统。,构建,噬菌体克隆载体的基本策略：,14,插入型载体、取代型载体,根据切除的多少，将,-,DNA,分为两大类载体：,1,、缩短长度,野生型,:,上限,51kb,-,DNA,：,48.5kb,，外源基因,2.5kb,-DNA,上有,40-50%,的,DNA,是复制，裂解所不必需的，切除便提高装载量。,15,插入型载体（,insertion vector,）,经改造后,只具有,一个,可供外源,DNA,插入的,克隆位点,长度为,37kb,，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入片段最大为,14,kb,.,必须携带标记基因,16,取代型载体（,substitution vector,）,具有,成对的克隆位点,空载的载体,DNA,只,26kb,，不能被包装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因,.,17,插入型载体只能承受,较小分子量,（一般在,10kb,以内）的外源,DNA,片段的插入，广泛应用于,cDNA,及小片段,DNA,的克隆。,应用：,替换型载体可承受,较大分子量,的外源,DNA,片段的插入，所以适用于,克隆高等,真核生物的染色体,DNA,。,18,删除重复的酶切位点,:,野生型,DNA,链上有,5,个,EcoRI,位点和,7,个,HindIII,位点，不利于重,组操作，必须删除至,1,-2,个,.,为了便于,各种来源的,DNA,片段的克隆，还,需要,增加,一些,单一的酶切位点,.,2,、酶切位点的删除或增加,采用定点突变技术或甲基化酶处理必需区内的酶识别序列使其失活。,19,3,、灭活某些与裂解周期有关的基因,将,无义突变,引入噬菌体裂解周期所需的基因,，,如,将头部包装蛋白基因的,CAG,突变成,UAG,。,这些,噬菌体只能在具有,特异校正基因编码产物的,菌株内,繁殖。,当这种,DNA,进入一般大肠杆菌菌株后，不能合,成,有活性的头部蛋白,，也就,不能被包装和裂解细,菌,，可阻止有害重组体的生物污染及扩散。,基因工程实验中使用的受体是具有,琥珀型突变体校正功能,的菌株。,20,4,、加装选择标记,野生型,-DNA,上缺少合适的选择标记，因此加,装选择标记是,-DNA,克隆载体构建的重要内容。,选择标记主要有两类：,免疫功能类标记,颜色反应类标记,21,(1),免疫功能失活标记,(cI,筛选,),加装选择标记,cI,基因,cI,基因,编码一种,阻止,-,噬菌体进入,溶菌循环,的阻遏物。,含有完整标记基因的,-,载体进入受体细胞后，建立,溶源状态,，细菌生长缓慢，,形成混浊斑,；,当,外源,DNA,插入,到标记基因中，,基因灭活，,-,重组分子便进入,溶菌循环，,形成,透明斑。,22,(2),加装选择标记,lacZ,（,蓝白斑筛选）,lacZ,基因编码,-,半乳,糖苷酶，,能催化无色的,X-gal,生成,蓝色化合物,。,当外源基因插入到,lacZ,基因中，基因灭活，,不能,合成,蓝色化合物,；,而空载体,-DNA,则产,生,蓝色透明斑,。,23,5,、建立,-,噬菌体的体外包装系统,体外包装原理：,噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的,。,头部基因,发生了,突变,的噬菌体只能,形成尾部和头部蛋白所需的蛋白因子,；,将这两种突变型的噬菌体的,提取物混合起来，,便能够在,体外装配成有生物活性,的噬菌体颗粒。,尾部基因,发生了,突变,的噬菌体则只能形成,头部和,尾部蛋白所需的蛋白因子。,24,25,（三）,-DNA,作为载体的优点,可在,体外包装,成噬菌体颗粒，,高效转染,大肠杆菌,-DNA,载体的装载能力为,25 kb,，远远大于质粒,的装载量重组,-DNA,分子的,筛选较为方便,重组,-DNA,分子的,提取比质粒容易,.,-DNA,载体适合,克隆和扩增外源,DNA,片段,，常用于,构建基因文库,缺点：,(1),需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费用又高；,(2),没有质粒的用途广泛。,26,