整套教学课件《基因工程概论》

,单击此处编辑母版标题样式,编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,基因工程,课程设置与成绩构成,授课形式：,课堂讲授、讨论、互动式教学,考 试：,平时成绩,(15%)+,实验成绩,(15%)+,期末成绩,(70%),平时成绩：,（,1,）课堂表现 （,2,）作业 （,3,）小考,主要参考资料,王关林等,.,植物基因工程,吴乃虎等,.,基因工程原理,贺淹才,.,基因工程概论,生物技术通报,中国生物工程杂志,农业生物技术学报,生物工程学报,植物学报,生物技术,遗传学报,中国农业科学,作物学报,Molecular genetics and genomics,Animal biotechnology,Nature genetics,Plant cell,Science,Nature,TAG,基因工程,第一章 导 论,第二章 基因操作的工具酶,第三章 基因克隆的载体,第四章 基因克隆的策略,第五章 克隆基因的表达,第六章 基因工程的基本技术,第一章 导 论,第一节 基因工程的诞生,第二节 基因工程的研究内容,第三节 基因工程的成就和前景展望,细胞的发现,1665,年，英国物理学家,R.,胡克,在用显微镜观察木塞的薄片时，发现木塞是由蜂窝状的小室组成的，并把这种结构称为,细胞,。,随着显微镜的改进，人们逐渐积累了大量有关细胞的资料。,1838,年,，德国植物学家,M.J.,施莱登,在综合自己和他人观察研究的基础上，提出细胞既是独立的生命，又是植物机体的基本结构单位。,1839,年，德国动物学家,T.,施旺,发现动物也是由细胞组成和发育而来的，从而提出细胞是一切生命机体的基本单位。不过，施莱登与施旺所理解的细胞仅有一个固定的细胞壁围绕着一团胞质，并在中间有一个核。到,1882,年，通过,R.,雷马克、,W.,霍夫迈斯特、,E.A.,斯特劳斯伯和,W.,弗莱明等人的工作，才对细胞的有丝分裂过程有较为细致的观察。此后，细胞核的作用与意义日益受到重视。,1859,年,物种起源,进化论的提出,Mendel G.J. (1822-1884). 1856-1864,豌豆杂交实验。,Mendel,和遗传规律的研究,遗传学的奠基人奥地利人,孟德尔,（,Gregor,Johann,Mendel,1822,1884,），在布尔诺,(,现属捷克,),的奥古斯丁教派修道院的菜园里，挥洒了,8,年的汗水，于,1865,年,2,月在奥地利自然科学学会会议上报告了自己植物杂交研究结果，第二年在奥地利自然科学学会年刊上发表了著名的,植物杂交试验,的论文，发现了遗传学的两个基本规律,分离律和自由组合规律。,文中指出，生物每一个性状都是通过,遗传因子,来传递的，遗传因子是一些独立的遗传单位。,遗传因子作为基因的雏形名词诞生了,。虽然孟德尔还不知道这种物质是以怎样的方式存在，也不知道它的结构是怎样的，但孟德尔,“,遗传因子,”,的提出毕竟为现代基因概念的产生奠定了基础。 从那时起遗传学家踏上了寻找基因实体的艰难历程。,1900,年,Mendel,遗传规律被重新发现,遗传学的元年,1866,年发表论文，提出分离规律和独立分配规律,1909,年,(,约翰逊,)W.Johansen,(1859-1927),发表了,“,纯系学说,”,首先提出了,“,基因,”,的概念，代替了,Mendel,“,遗传因子,”,的 概念。,基因概念的提出,1909,年丹麦遗传学家约翰逊（,W.Johansen,1859,1927,）在,精密遗传学原理,一书中提出,“,基因,”,概念，以此来替代孟德尔假定的,“,遗传因子,”,。从此，,“,基因,”,一词一直伴随着遗传学发展至今。基因一词来自希腊语，意思为,“,生,”,。约翰逊还提出了,“,基因型,”,与,“,表现型,”,这两个含义不同的术语，初步阐明了,基因与性状,的关系。不过此时的基因仍然是一个未经证实的，仅靠逻辑推理得出的概念。,1910,年以后，,Morgan T.H.,等提出了基因的连锁遗传规律，染色体遗传理论发展为,细胞遗传学,连锁遗传规律的提出,美国实验胚胎学家、遗传学家摩尔根,（,Thomas,Hunt,Morgan,1866,1945,）和他的学生们于,1908,年前后开始利用果蝇作了大量的潜心研究。发现了遗传学的第三个基本规律,连锁互换规律,，从而继承和发展了孟德尔的遗传学说。,1926,年他的巨著,基因论,出版，从而建立了著名的基因学说，他还绘制了著名的果蝇基因位置图，首次完成了当时最新的基因概念的描述，即基因以直线形式排列，它决定着一个特定的性状，而且能发生突变并随着染色体同源节段的互换而交换，它不仅是决定性状的功能单位，而且是一个突变单位和交换单位。 这种认识把基因与染色体联系起来，,说明了基因的物质性，基因存在的场所及排列方式，基因从此就不再是一个抽象的概念了。,当然这时人们仍然不了解基因的化学本质以及基因是如何控制生物性状的。,1941,年，,Beadle,（比得尔）,G.W.,等证明了基因通过酶起作用，提出了,“,一个基因一个酶,”,的假说,一个基因一个酶,1941,年，比得尔,（,G.W.,Beadle,1903,）,和塔特姆,（,E.L.,Tatum,1909,1975,）,提出了,“,一个基因一种酶,”,的假说，认为基因对性状的控制是通过基因控制酶的合成来实现的。这一假说在,20,世纪,50,年代得到充分验证，后来发现有些蛋白质不只由一种肽链组成，如血红蛋白和胰岛素，不同肽链由不同基因编码，因而,1941,年比德尔和塔特姆提出,一个基因一个酶学说，证明基因通过它所控制的酶决定着代谢中生化反应步骤，进而决定生物性状。,又提出了,“,一个基因一条多肽链,”,的假设。,“,一个基因一种酶,”,和,“,一个基因一条多肽链,”,理论的提出，,大大促进了,分子,遗传学的发展，人们急切期望能搞清楚基因的化学结构。,随着超速离心机、超微分析法、组织化学染色法、,X,射线衍射技术和电子显微镜应用于生物学的实验研究，又发现了更多的细胞器，如内质网、溶酶体等等，并能分离、提纯和测定各种细胞器及其内含物。,20,世纪,50,年代中期，生物学家们还阐明了细胞内部的两种最重要的分子,蛋白质与核酸的结构,，,60,年代揭示了,生物遗传信息的传递规律,。,基因和基因工程的概念,基因,：,是,DNA,分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。,根据其是否具有转录和翻译功能可以把基因分成,3,类,。,第一类,是编码蛋白质的基因，它具有转录和翻译功能，包括编码酶和结构蛋白的结构基因以及编码阻遏蛋白的调节基因；,第二类,是只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括,tRNA,基因和,rRNA,基因；,第三类,是不转录的基因，它对基因表达起调节控制的作用，包括启动基因和操纵基因。,随着分子生物学研究的深入，人们能够在分子水平上认识基因的结构与功能，发现了基因结构中存在有,“,移动基因,”,、,“,断裂基因,”,、,“,重叠基因,”,、,“,假基因,”,等，提出了有关基因结构与功能的新概念。,基因和基因工程的概念,移动基因,（,movable gene,）,：,又叫跳跃基因（,jumping gene,）或转座子（,transposon,），是染色体,DNA,上可复制和位移的一段,DNA,序列。,断裂基因,：,世纪年代，法国生物化学家,Chamobon,和,Berget,在研究鸡卵清蛋白基因的表达中发现，细胞内的结构基因并非全部由编码序列组成，而是在编码序列中间插入了无编码作用的碱基序列，这类基因被称为间隔基因或断裂基因。,基因和基因工程的概念,重叠基因（,overlapping gene,）,：,在同一部分的,DNA,序列具有合成两种不同蛋白质的信息，即同一段,DNA,片段能够编码两种甚至多种蛋白质分子。多见于病毒基因组，其它生物细胞中仅见于线粒体和质粒,DNA,。,假基因（,pseudogene,）,：,或称伪基因，是基因家族在进化过程中形成的无功能的残余物。,基因和基因工程的概念,重复序列（,repeat sequence,）,：,基因序列的多拷贝。多拷贝与转基因的失活有关。,基因组（,genome,）,：,有关特定生物全部染色体的遗传物质的总和，其大小通常以其全部的,DNA,碱基对数（）来表示。现在基因组指自主复制的单位所应有的一套基因，因而有质粒基因组和病毒基因组的名称。,基因和基因工程的概念,基因工程（,genetic engineering,）,：,也叫基因操作、遗传工程或重组体,DNA,技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（克隆）和行使正常功能（表达），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。,一般认为,1973,年是基因工程诞生的元年,上世纪,40,年代,70,年代初,分子生物学领域,理论上的三大发现,和技术上的三大发明,对于基因工程的诞生起到了决定性的作用,。,第一节 基因工程的诞生,1944,年，,Avery,（艾弗里）,O.T.,利用肺炎双球菌转化实验,1,、,DNA,是遗传物质被证实,40,年代，证实,DNA,是遗传物质,早在上世纪,20,年代，已经知道染色体由,DNA,和蛋白质构成，但组成蛋白的,氨基酸有,20,种,，而组成,DNA,的,核苷酸只有,4,种,，什么是遗传物质？,1928,年，英国微生物学家,F. Griffith,（格里菲思）著名的肺炎双球菌感染小白鼠实验。,（,1,）,S,型：注射小白鼠，死亡。,（,2,）,S,型，,65,加热：注射小白鼠，活。,（,3,）,R,型：注射小白鼠，活。,（,4,）,65,加热,S,型,+R,型：注射小白鼠，死亡。死鼠体内得到了,S,型菌。,40,年代，,DNA,是遗传物质被证实,1944,年，美国洛克菲勒研究所的,Oswald Avery,等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。,（,1,）,S,型菌无细胞提取物及其,纯化的,DNA,都可使,R,型菌转变成,S,型菌；,（,2,）经,DNase,处理的,S,型菌无细胞提取物失去了转化作用。,（,3,）经,胰蛋白酶,处理的,S,型菌无细胞提取物仍有转化作用。,不仅证实了,DNA,是遗传物质，而且证明了,DNA,可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是,现代生物科学的革命性开端,。,Watson,和,Crick,2,、,DNA,双螺旋模型的提出,50,年代，,DNA,的双螺旋模型的提出,和,DNA,复制机理的阐明,DNA,是遗传物质已被证实，但是,DNA,是怎样携带并传递遗传信息的？在细胞增殖过程中，,DNA,是怎样复制的？因此，对于,DNA,结构的研究成为了当时生物学家研究的热点。,1953,年，,Francis Crick,和,James Watson,搜集了力所能及的资料，提出了,DNA,的双螺旋模型。,随后，,DNA,的,半保留复制,和,半不连续,复制机理也被阐明，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。,DNA,分子结构模式图,立体结构,平面结构,威尔金斯,(M.,Wilkins),和富兰克林,(,Rosalind,Franklin,),的,X,射线衍射分析,分子遗传学的诞生,Nireberg,（尼伦伯格）等为代表的,一批科学家,3,、,“,中心法则,”,的提出,科拉纳（,H.G.,Khorana,）,尼伦伯格（,M.W.,Nirenberg,）,特明（,H.M.,Temin,）,60,年代，确定了遗传信息的传递方式（中心法则）,既然，,DNA,是遗传信息的载体，那么它是如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？,以,Nireberg,等为代表的一批科学家,经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到,1966,年，全部破译了,64,个密码子，,并提出了遗传信息传递的“中心法则”。,一般认为,1973,年是基因工程诞生的元年,上世纪,40,年代,70,年代初,分子生物学领域,理论上的三大发现和,技术上的三大发明,对于基因工程的诞生起到了决定性的作用,。,第一节 基因工程的诞生,Smith,等分离并纯化了限制性核酸内切酶,Hin,d II,，,1972,年，,Boyer,等相继发现了,co,R I,一类重要的限制性内切酶。,1,、核酸限制性内切酶的发现和应用,1967,年，世界上个实验室同时发现了,DNA,酶。,197,0,年，,Khorana,实验室又发现了,T4,噬菌体,DNA,连接酶。,2,、,DNA,连接酶的发现和应用,1972,年，美国,Stanford,大学的,P. Berg,等首次成功地实现了,DNA,的体外重组；,3,、载体的发现及其应用,1973,年，,Stanford,大学的,Cohen,等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。,这一年被定为基因工程诞生的元年。,基因工程的诞生,Cohen,等的重组实验示意图,Tc,r,Ne,r,Eco,RI,Eco,RI,连接酶,Tc,r,Ne,r,双抗重组菌落,基因工程发展史上首次实现了重组,DNA,的细菌转化,第一节 基因工程的诞生,一般认为，,1973,年是基因工程诞生的元年。,上世纪,40,年代,70,年代初,分子生物学领域,理论上的三大发现,和,技术上的三大发明,对于基因工程的诞生起到了决定性的作用,。,第一章 导 论,第一节 基因工程的诞生,第二节 基因工程的研究内容,第三节 基因工程的成就和前景展望,什么是克隆（,Clone,）,作为名词使用时，是指某一个体（或细胞、分子等）通过无性繁殖的方式产生的具有相同遗传背景的后代（或子细胞、分子等）组成的集体（或群体）；作为动词使用时，指产生上述集体或群体的过程。,所以，植物的无性繁殖（如马铃薯的生产）、细菌的无性繁殖以及重组,DNA,分子通过工程菌的繁殖等过程都是一个克隆的过程。,那么，克隆动物是怎么回事呢？,基因工程研究的主要内容,1,、基础研究。,包括：构建一系列克隆载体和相应的表达系统、建立不同物种的基因组文库和,cDNA,文库、开发新的工具酶、探索新的基因工程新技术、新的操作方法等。,2,、克隆载体的研究。,构建克隆载体是基因工程技术的中心环节。,3,、受体系统的研究。,原核生物如大肠杆菌；真核生物如酵母菌、高等植物等。,4,、目的基因研究。,3,大类目的基因：与医药有关的基因；抗病虫害和恶劣生境的基因；编码具有特殊营养价值的蛋白或多肽的基因。,5,、生物基因组学研究。,6,、应用研究。,包括基因工程药物研究、基因疫苗研究、转基因植物和动物的研究以及在酶制剂工业、食品工业、化学工业与能源工业及环境保护等方面的应用。,基因工程研究的基本步骤,1,、从生物体中分离得到目的基因（或,DNA,片段）,2,、在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到,重组,DNA,分子。,3,、将重组,DNA,分子导入受体细胞中，并进行繁殖。,4,、选择得到含有重组,DNA,分子的细胞克隆，并进行大量,繁殖，从而使得目的基因得到扩增。,5,、进一步对获得的目的基因进行研究和利用。比如，,序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究,和利用等。,基因工程的基本流程,基因分离酶切,载体酶切,基因和载体连接,导入细菌,重组质粒繁殖,重组克隆的选择,序列分析和基因表达等研究,导入植物细胞,第一章 导 论,第一节 基因工程的诞生,第二节 基因工程的研究内容,第三节 基因工程的成就和前景展望,基因工程的兴起,1977,年，激素抑制素的发酵生产成功,。,Itakara,等，化学合成的激素抑制素基因和大肠杆菌,-,半乳糖（苷）激酶基因插入到,PBR322,中得到重组质粒，并通过大肠杆菌生产出含有激素抑制素的嵌合型蛋白，经溴化氰处理后释放出了有生物活性的激素抑制素。,首次实现了真核基因的原核表达。用价值几美元的,9,升培养液生产出,50,毫克的生物活性物质，这相当于,50,万头羊脑的提取量。,1978,年，,Goeddel,等，,人胰岛素,的发酵生产成功。,1979,年，,Goeddel,等，又在大肠杆菌中成功表达了,人生长激素,基因。,1980,年，,Nagata,等， 遗传工程菌生产,干扰素,获得成功。,1981,年， 用遗传工程菌生产的生物制剂包括动物,口蹄疫疫苗、乙型肝炎,病毒表面抗原及核心抗原、,牛生长激素,等。,1982,年， 重组,DNA,技术生产的药物,-,人胰岛素进入商品化生产,。,1983,年， 基因工程生产,狂犬病疫苗,取得突破型进展。,1997,年，动物基因工程产品销售额约,1.8,亿,$,转基因小鼠,人类秃顶,Nature Biotechnology, 1999,17(1):9,转基因家蚕,防弹衣,Nature Biotechnology, 1999,17,（,5,）：,412,表皮干细胞能产生保护身体的外层皮肤，还有能产生头发和皮脂腺的毛囊。在衰老的皮肤中，一种叫做,Smad7,的蛋白质的生产过量，该蛋白会引发脱发和皮脂腺生长。,研究人员构建出一种遗传改造小鼠，这种小鼠的皮肤（包括表皮干细胞）表达了与衰老皮肤类似的,Smad7,水平。他们发现,Smad7,的过度表达将表皮干细胞分化从形成毛囊转换到了皮脂腺，从而导致小鼠出现秃顶和油性皮肤。,人类的秃顶也随性别而不同,在男性中秃顶基因表现为显性,即,BB,和,Bb,都为秃顶,;,在女性中秃顶基因则表现为隐性,即,Bb,不为秃顶。,蜘蛛丝具有强度大、弹性好、柔软、质轻等优良性能，尤其是具有吸收巨大能量的能力，是制造防弹衣的绝佳材料。蜘蛛丝里的牵引丝蛋白是目前人类已知强度最大的材料，用牵引丝蛋白纺织出来的防弹衣将把弹头或弹片击入士兵体内的危险降到最低限度，用蜘蛛丝做的防弹背心性能比芳纶更好。几年前，美国已成功地从蜘蛛体内提取蜘蛛丝用来制造防弹背心，最近，纳蒂克研究中心的工程师和分子生物学家正在,研究一种能吐出很坚韧的金黄色蜘蛛丝的巴拿马蜘蛛,，,以便给士兵配备一种轻便的防弹背心。美国陆军和麻省理工学院正在研究用蜘蛛丝制造一种全新的军装，这种军装不仅能成为士兵的防弹装甲，还可以自动适应不同温度环境，甚至能为生病或受伤的士兵起到一定的医疗作用。我国四川川大天友生物工程股份有限公司将蜘蛛丝蛋白基因转移到家蚕上，用高蜘蛛丝蛋白含量的,家蚕丝,作为新防弹衣的材料。,另外，蜘蛛丝还可制成战斗飞行器、坦克、雷达、卫星等装备以及军事建筑物等的防护罩，还可用于织造降落伞，这种降落伞重量轻、防缠绕、展开力强大、抗风性能好，坚牢耐用。,83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02,First,transgenic,plant,Delay-ripening tomato,Commercialized in the US,First,field,tests,Herbicide resistant, insect resistant plants commercialized,GM maize approved by EU,First Bt corn plants,Rotting resistant tomato approved by FDA,植物基因工程的发展迅速,植物转基因育种的发展优势,1,、扩大了作物育种的基因库,转基因育种,打破了,常规育种的,物种界限,，来源于动植物和微生物的有用基因都,可以导入作物，培育成具有某些特殊性状的新型作物品种。,2,、提高了作物育种的效率,作物转基因育种不仅大大,缩短育种年限,，而且可成功地改良某些单一性状却不,影响改良品种的原有优良特性。,3,、减轻了农业生产对环境的污染,转基因抗虫棉花的大面积种植和推广，不仅可以,减少,化学杀虫剂,对棉农及天敌,的伤害,，而且可以大幅度降低用于购买农药和虫害防治的费用。另外，随着高,效固氮转基因作物及高效吸收土壤中磷元素等营养元素的转基因作物不断问世,和推广，,农用化肥的利用率,将极大地,提高,，这对减少农田污染具有重要意义。,4,、拓宽了作物生产的范畴,各种有价值的,蛋白产品,都可以利用植物反应器进行高效生产，番茄、马铃薯、,莴苣和香蕉等作物已被成功用于生产口服疫苗。另外，各种,工业原料,，比如纤,维素、海藻糖和可降解塑料等,也可以用植物来生产。有人甚至预言，除了钢筋,混凝土之外，未来的转基因作物将可能生产出人类所需要的一切产品。,全球转基因作物种植面积（百万公顷）,自,1996,年到,2007,年，全球基因工程农作物种植面积累计达到,6.9,亿公顷，,12,年间增长了,67,倍。,全球转基因作物导入特性比例,全球转基因作物销售收入（亿美元）,全球不同转基因作物和应用面积,植物基因工程研究,植物基因组计划,植物分子育种,高产、优质、高效和多抗性,植物作为反应器,香蕉、马铃薯、番茄等,玉米、棉花、大豆、高粱和番茄,酒精、石油、工业酶等,转基因,植物,自,1983,年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速，成功的转基因植物已达,60,多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过,500,例。其中包括,烟草、番茄、,马铃薯、矮牵牛、胡萝卜、向日葵、油菜、苜蓿、亚麻、甜菜、,玉米、棉花、芹菜、荷花、黄瓜、拟南芥、大白菜、大豆、水稻、莴苣、豇豆、小麦以及大麦等。,基因与环境保护,转基因颠茄能高效吸收和分解污染物：,日本科学工作者在对大约 种植物进行调查研究后发现，颠茄这种植物有吸收和分解污染源物质多氯化联苯的能力。在此基础上他们对该植物进行转基因处理，即把加速根部生长的功能基因导入颠茄细胞中，培育出了生长速度快、根部发达的重组基因颠茄，从而大大提高了其吸收和分解污染物质的能力。生产实践表明，严重超标的工厂废水能够被它吸收。重组基因颠茄在环境保护中的特殊作用由,日经产业新闻,公布后，引起了国际上的广泛关注，很多国家积极引进这一现代生物技术成果，已取得了很好的环保效果。,转基因鹅掌楸树能有效分解有毒物质：,美国佐治亚大学的斯科特,梅克莱和他的课题成员把一种名为,“,”,的功能基因导入美国鹅掌楸的树木。这种功能基因来自细菌，它能消除环境中汞造成的污染。斯科特在研究报告中指出：,“,检测已经证实，这种经过基因重组的美国鹅掌楸在转导这种基因后，获得了表达，能够有效地消除汞离子造成的环境污染。,”,我国基因工程部分研究进展,转基因抗病虫植物,我国科学家将抗虫基因导入棉花，获得了抗虫植株，对棉蛉虫的抗虫效果十分显著，现正进行田间加代繁殖。抗黄矮病、赤霉病、白粉病转基因小麦和抗青枯病马铃薯也已研究成功，开始田间加代繁殖。,基因工程疫苗,乙型肝炎是危害我国人民健康的严重疾病，我国乙肝病毒携带者,1,亿,1,千万人，其中,40,左右的慢性肝炎可能发展成为肝硬化和原发肝癌。以往乙肝疫苗是从人血清中提取，基因工程乙肝疫苗的研制成功，不仅有巨大的经济效益，而且有巨大的社会效益。基因工程乙肝疫苗是我国正式批准投放市场的第一种高技术疫苗，在,20,多项指标上达到国际先进水平，获国家科技进步一等奖。继乙肝疫苗之后，我国又研制成功了痢疾、霍乱等数种基因工程疫苗，并经国家批准进入临床试验。,基因工程药物,干扰素,是一种广谱的抗病毒和抗肿瘤高技术药物，对防治病毒性肝炎和恶性肿瘤有重要的作用。现已有了,3,个品种的基因工程干扰素获得国家新药证书，开始大批量生产。除此之外，我 国还研制成功了肝癌导向药物（生物炸弹）、系列恶性肿瘤辅助治疗药物等十余种基因工程药物，有些已获试生产文号或进入中试开发阶段。,动物克隆和转基因研究,16,日，“神舟”五号成功着陆的同一天，包括两头转基因体细胞克隆牛在内的,10,头体细胞克隆牛,现身山东梁山县。我国转基因体细胞克隆技术及体细胞克隆技术的研究与应用达到国际前沿水平。,2003,年,3,月,25,日,出生的体细胞克隆牛“乐娃”，由于成功地转入了绿色荧光蛋白基因，成为我国首例转基因体细胞克隆牛，标志着我国在转基因体细胞克隆技术方面的新突破。,2003,年,10,月,4,日,，第二头转基因体细胞克隆牛,“岩娃”,的呱呱坠地，同时创造了两个世界首次，即,首次,获得了用于治疗人类胃溃疡疾病的转,有人岩藻糖转移酶基因,的体细胞克隆牛；,首次,获得了在同一头牛中转有,3,种外源基因的转基因体细胞克隆牛。这标志着我国已经成熟掌握了转基因体细胞克隆牛的生产技术体系，在该领域的研究跻身于世界的前列。,岩藻糖转移酶,催化形成的抗原物质可以特异调节幽门螺旋杆菌与人胃上皮细胞结合。而幽门螺杆菌正是,慢性浅表萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃增生性息肉、胃癌等重要致病菌,，被国际卫生组织列为一类致癌病原。据世界卫生组织公布，世界人口的,50 %,80 %,均感染了幽门螺杆菌，在中国，达到,70%,。由于岩藻糖抗原仅仅存在于人类和灵长类的动物体内，通过转基因克隆方法将人岩藻糖转移酶基因转入牛基因组内，牛奶中表达产生岩藻糖抗原。转基因牛奶可以作为一种口服药物达到治疗或预防胃病的目标。,基因治疗,Gene Therapy,基因治疗是指用基因工程技术来治疗带有错误基因的一类病，比如遗传疾病。,最早采用基因治疗的是一种先天性免疫缺乏症，又称气泡男孩症，患病婴幼童因为腺脱胺基因有缺陷，骨髓不能制造正常白血球获得免疫功能。这项临床试验在美国的女病童证明很成功。,基因治疗,Gene Therapy,美国威斯康星大学詹姆斯,汤姆森实验室和日本京都大学教授山中伸弥领导的研究小组,2007,年,11,月,20,日分别在,科学,和,细胞,杂志上发表论文，宣布成功把人体皮肤细胞改造成类似胚胎干细胞的,“,万能细胞,”,。（旅美华人女科学家俞君英参与了这次皮肤干细胞的研究）,研究人员借助逆转录酶病毒为载体，把,4,种基因注入皮肤细胞，这些特定基因能够,“,重组,”,皮肤细胞的基因，从而得到特定类型的人体干细胞。从理论上说，这种干细胞的功能类似通过胚胎克隆技术取得的胚胎干细胞，能够最终培育成人体组织或器官。由于这种干细胞能通过基因组合控制，因此有,“,万能细胞,”,之称。,学界对这一研究给予高度评价，称这一突破为生物科学的,“,里程碑,”,。因为这种被称为,“,直接改造,”,的技术不仅能避免人体胚胎克隆技术引发的伦理争议，其高效、便利也为进一步医学应用打开了大门。世界首只克隆羊多利的,“,助产士,”,、英国科学家威尔默特在一份声明中说：,“,我们现在可以设想这么一个时代：能够以一种简单方式制造干细胞，任何人身上的组织标本均能培育出任何组织器官。,”,致力于人体胚胎克隆技术研究的美国细胞高级技术研究所首席科学家兰扎说：,“,这项研究是一个了不起的科学里程碑。从生物学意义上讲，相当于莱特兄弟制造的首架飞机,”,。,普斯陶伊事件,1998,年，苏格兰,Rowett,研究所的科学家普斯陶伊,(PusztaiA),在电视上宣布了他的一项试验结果：用转雪花莲凝集素,(GNA),基因的马铃薯喂大鼠,10,天后，老鼠器官生长异常，身体和器官重量减轻,免疫系统受损。此事引起国际轰动。,1999,年美国,斑蝶事件,是指经过基因工程改造的抗虫玉米的花粉传到乳草上，而斑蝶吃了这种乳草则表现出不同程度的伤害，如幼虫死亡或不能成长等。,Apart from Some Minor Effects,Things Are Looking Very Promising !,思 考 题,什么是基因，它和细胞、染色体的关系如何？,为什么认为,1973,年是基因工程诞生的元年？,上世纪,4070,年代初分子生物学领域理论上和技术上的哪些重大突破对于基因工程的诞生起到了决定性的作用？,什么是克隆，你知道当前动物克隆的基本原理么？它和植物的克隆有何区别？,在你的脑海中，基因工程的基本流程是怎样的？基因工程在现实生活中有何应用价值？,植物转基因育种比起常规育种来有哪些优势？你知道转基因育种的不足吗？,基因工程概论,基因工程概论,第一章 导 论,第二章 基因操作的工具酶,第三章 基因克隆的载体,第四章 基因克隆的策略,第五章 克隆基因的表达,第六章 基因工程的基本技术,第二章 基因操作的工具酶,基因工程的工具酶,(instrumental enzyme of gene engineering):,是应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取和重组体,DNA,制备等程序中所需要的酶类。,能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶称为,核酸酶,。,核酸酶的,分类,：,第二章 基因操作的工具酶,1,、根据核酸底物分：,（,1,）,RNA,酶（,RNase,）：作用底物是,RNA,；,（,2,）,DNA,酶（,DNase,）：作用底物是,DNA,；,（,3,）底物非专一性核酸酶：底物可以是,DNA,也可以是,RNA,。,第二章 基因操作的工具酶,2,、根据对底物作用方式分：,（,1,）核酸内切酶（,endonuclease,）：从核酸内部切割磷酸二酯键；,（,2,）核酸外切酶（,exonuclease,）：从核酸分子末端开始一个一个切割核苷酸；,（,3,）少数核酸酶：既能够内切又能够外切。,第二章 基因操作的工具酶,3,、根据对底物碱基专一性分：,（,1,）碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）；,（,2,）碱基非专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随意）。,第二章 基因操作的工具酶,第一节 限制性核酸内切酶及其应用,第二节,DNA,连接酶及其应用,第三节,DNA,聚合酶及其应用,第四节 修饰性工具酶,Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer.,1,、限制性核酸内切酶的发现,2,、限制性核酸内切酶的分类和命名,3,、,II,型限制性核酸内切酶的基本特性,4,、限制性核酸内切酶的消化反应,第一节 限制性核酸内切酶及其应用,50,年代初发现了由寄主控制的,限制和修饰现象,(B),(K),大肠杆菌,B,大肠杆菌,K,1,1,4,10,4,10,4,E.O.P,成斑率,efficiency of plating,限制,修饰的酶学假说,(B),(B),酶切位点,不被修饰,噬菌体,DNA,被切割,酶切位点,被修饰,Methylation,基因组,DNA,不被切割,1968,年，,Meselson,和,Yuan,从大肠杆菌,K,和,B,中发现了,I,型限制性核酸内切酶；,1970,年，,Smith,和,Wilcox,从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个,II,型限制性核,酸内切酶,Hin,d II,，使得,DNA,分子的体外精确切割成为可能。,1,、限制性核酸内切酶的发现,2,、限制性核酸内切酶的分类和命名,3,、,II,型限制性核酸内切酶的基本特性,4,、限制性核酸内切酶的消化反应,第一节 限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的概念,限制性核酸内切酶（,Restriction endonucleases,）：,是一类能够识别双链,DNA,分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链,DNA,分子的核酸内切酶。,已经从近,300,种微生物中分离出了,500,余种限制性核酸内切酶。,限制性核酸内切酶的分类,1.,限制修饰活性,2.,内切酶的蛋白,质结构,3.,限制辅助因子,4.,切割位点,5.,特异性切割,6.,基因克隆中,I,型,单一多功能的酶,3,种不同亚基,ATP,、,Mg,2+,和,S-,腺苷甲硫氨酸,距特异性位点,1000bp,不是,无用,II,型,限制酶和修饰酶分开,单一成分,Mg,2+,特异性位点及其附近,是,非常有用,III,型,双功能酶,2,种亚基,ATP,、,Mg,2+,和,S-,腺苷甲硫氨酸,特异性位点,3,端,24-26bp,处,是,有用,限制性核酸内切酶的命名,1,、,寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成,3,个斜体,字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌,Escherichia,coli,表示为,Eco,流感嗜血菌,Haemophilus influenzae,表示为,Hin,；,2,、,用一个正体字母表示菌株的类型，比如,Eco,R,、,Hin,d,；,3,、,如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则,用罗马数字标出，比如,Eco,R,I,、,Hin,d,III,。,*,星号活性,(star activity):,也称星活性，同一类限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，例如酶浓度过高、反应液离子强度过低、,pH,改变、反应液中,Mg,2+,被,Mn,2+,代替、有机溶剂影响时等，酶切割位点专一性发生改变。这个特性称为星号活性。在这些酶制剂的包装和产品说明书上注明（,*,），以表示区别，提示使用者注意。,1,、限制性核酸内切酶的发现,2,、限制性核酸内切酶的分类和命名,3,、,II,型限制性核酸内切酶的基本特性,4,、限制性核酸内切酶的消化反应,第一节 限制性核酸内切酶,II,型限制性核酸内切酶的,3,大特点,1,、识别位点的特异性,每种酶都有其特定的,DNA,识别,位点，通常是由,4,、,5,、,6,或,7,个核苷酸组成的特定序,列（靶序列）。,2,、识别序列的对称性,靶序列通常具有双重旋转对称,的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。,3,、切割位点的规范性,双链,DNA,被酶切后，分布在两,条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平,末端的,DNA,分子）。,Sma I CCCGGG,GGGCCC,EcoR I GAATTC,CTTAAG,EcoR I,5,-G,AATT,C-3,3,-C,TTAA,G-5,Sma I,5,-CCC GGG-3,3,-GGG CCC-5,粘性末端,平末端,与,II,型核酸内切酶有关的几个概念,粘性末端,cohesive,ends,因酶切位点在两条,DNA,单链上不同（对称）酶切后形,成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很,容易,通过互补碱基的配对而重新,连接,起来。,平 末 端,Blunt end,因酶切位点在两条,DNA,单链上相同，酶切后形成的平齐,的末端结构，这种末端,不易,重新,连接,起来。,同裂酶,isoschizomers,能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。,同尾酶,isocaudamers,识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一,类限制性核酸内切酶。,注 意：,由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶,消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的,任一种所识别。,几种,II,型限制性核酸内切酶的酶切位点,Pst,I,Provindencia stuartii,164,CTGCAG,GACGTC,Haemophilus influenzae,Rd,经同尾酶消化的,DNA,末端连接示意图,5,XXXX,GGATCC,XXXXXX 3,3,XXXX,CCTAGG,XXXXXX 5,Bam,H I,5,XXXX,G GATCC,XXXXXX 3,3,XXXX,CCTAG G,XXXXXX 5,5,XXXX,AGATCT,XXXXXX 3,3,XXXX,TCTAGA,XXXXXX 5,Bgl,II,5,XXXX,A,GATCT,XXXXXX 3,3,XXXX,TCTAG,A,XXXXXX 5,5,XXXX,A,GATCC,XXXXXX 3,3,XXXX,TCTAG,G,XXXXXX 5,5,XXXX,A,GATCC,XXXXXX 3,3,XXXX,TCTAG,G,XXXXXX 5,Bam,H I,Bgl,II,推测酶切割位点出现的频率对于推断,DNA,酶切片段大小很有用。,假定,4,种核苷酸在,DNA,分子上出现的频率相同，那么靶序列为,6,个核苷酸的内切酶在每,4,6,（,=4096,）,个核苷酸中酶切位点就有一次出现机会。据此推算，一条,49000bp,长的,DNA,中有,12,个,6,核苷酸识别序列的酶切位点（,49000/4096,）。但事实上并非真正如此，因为,DNA,分子中,4,种碱基的出现频率并不均等。,识别位点在,DNA,分子上出现的频率,1,、限制性核酸内切酶的发现,2,、限制性核酸内切酶的分类和命名,3,、,II,型限制性核酸内切酶的基本特性,4,、限制性核酸内切酶的消化反应,第一节 限制性核酸内切酶,一个酶单位,（,U,）,指：,在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为,37,）下，,20,L,反应体系中,1h,完全降解,1 g DNA,所需要的酶量。,影响酶活性的因素很多，最重要的有：,A,。,DNA,的纯度和甲基化程度,B,。,甘油的含量（不超过,5%,）,C,。,反应体系中的离子强度,D,。,反应体系的,pH,值,E,。,反应的温度条件,（通常为,37,）,酶单位的定义和影响酶活性的因素,Buffer (10X) 2.0,L,Water 16.5,L,DNA 1.0,L,Enzyme 0.5,L,Volume 20.0,L,酶 切 反 应 的 基 本 步 骤,电泳,紫外分析,37 1h,加反应液,CK,M,Buffer (10X) 2.0,L,Water 16.5,L,DNA 1.0,L,Enzyme 0.5,L,Volume 20.0,L,1.0kb,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,CK,M,T,T,第二章 基因操作的工具酶,第一节 限制性核酸内切酶及其应用,第二节,DNA,连接酶及其应用,第三节,DNA,聚合酶及其应用,第四节 修饰性工具酶,Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer.,1,、,DNA,连接酶作用的特点,2,、,DNA,连接酶的反应条件,3,、,DNA,连接的策略,第二节,DNA,连接酶及其应用,DNA,连接酶的发现,环形,DNA,分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种,Nick,的酶存在。,1967,年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化在,2,条,DNA,链之间形成,磷酸二酯键,的酶,DNA,连接酶（,ligase,）,。,DNA,连接酶,由大肠杆菌基因组,DNA,编码，以,NAD,+,作为能源辅助因子,；,T4DNA,连接酶,由大肠杆菌,T4,噬菌体,DNA,编码，以,ATP,作为能源辅助因子。,（,1970,年） 容易制备，而且可以连接完全配对的平末端,DNA,分子，所,以在基因克隆中应用广泛。,Nick,Nick,DNA,连接酶的性质,大肠杆菌的,DNA,连接酶是一条分子质量为,75kD,的多肽链。它对胰蛋白酶敏感，可被其水解。,DNA,连接酶在大肠杆菌细胞中有,300,个分子，主要功能就是在,DNA,聚合酶,催化聚合，添满双链,DNA,上的单链间隙后封闭,DNA,双链上的缺口。这在,DNA,复制、修复和重组中起着重要的作用。,T4 DNA,连接酶分子是一条分子质量约为,60kD,的多肽链，其活性很容易被,0.2mol/L,的,KCl,和精胺所抑制。,T4 DNA,连接酶可连接,DNA-DNA,、,DNA-RNA,、,RNA-RNA,和双链,DNA,黏性末端。,DNA,连接酶作用的特点,A.,连接的两条链必须分别具有,3,端自由羟基（,-OH,）,和,5 ,端磷酸基团（,-P,），而且只有这两个基团彼,此相邻时才能进行连接反应；,B.,在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过,程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有,两种能量分子，即,ATP,和,NAD+,。,OK,NO,载体去磷防止自连的应用示例,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,连接酶,连接酶,连接酶,碱性磷酸酶,2Pi,寄主修复缺口,载体自连或产生二聚体等,1,、,DNA,连接酶作用的机理,2,、,DNA,连接酶的反应条件,3,、,DNA,连接的策略,第二节,DNA,连接酶及其应用,DNA,连接反应的条件,连接反应最佳温度为,37,，但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，,EcoRI,粘性末端连接部位只有,4,个碱基对，很容易断开。所以,通常在,4-15,连接。,影响连接效率的因素有：,A.,温度（最主要的因素）,B. ATP,的浓度,( 10,M - 1M,),C.,连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）,D.,反应时间（通常连接过夜）,E.,插入片段和载体片段,的摩尔比,转化,4,过夜,加反应液,CK-,重组菌落,CK+,DNA,连接反应,阳性对照：,阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落。确定连接产物已经转化到感受态细胞中。将感受态细胞进行铺板。,阴性对照：,阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落。仅将感受态细胞进行铺,板，涂布的是没有转质粒的,空菌。,这么做的目的是：,如果最后,阴性对照的盘子都有菌落生,长了，那这批结果必然不可,信；如果阳性对照长而目的,盘子没长，那就说明是转化,手法出了问题；如果阳性对,照都没长，那就说明这批感,受态细胞有问题。,转化,4,过夜,加反应液,CK-,重组菌落,CK+,1,、,DNA,连接酶作用的机理,2,、,DNA,连接酶的反应条件,3,、,DNA,连接的策略,第二节,DNA,连接酶及其应用,粘性末端,DNA,片段的连接,Nick,Nick,平末端,DNA,片段的末端加尾连接法,3,3,5,5,3,3,5,5,末端核苷酸转移酶,+dATP,+dTTP,3,3,5,5,3,3,5,5,AAAAA,TTTT,DNA,聚合酶,和,T4DNA,连接酶,平末端,DNA,片段加接头连接法,衔接物,(linker),，也叫接头,，,是由人工化学合成的一段,10-12,个核苷酸的,DNA,双链，其中包含有,1,个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的,5,端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用,T4DNA,连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的,DNA,片段。,CCGAATTCGG,GGCTTAAGCC,磷酸化,CCGAATTCGG,GGCTTAAGCC,P,OH,OH,P,P,P,OH,OH,T4,连接酶,CCGAATTCGG,GGCTTAAGCC,P,OH,P,OH,Eco,R I,CCGAATTCGG,GGCTTAAGCC,AATTCGG,GCC,CCG,GGCTTAA,第二章 基因操作的工具酶,第一节 限制性核酸内切酶及其应用,第二节,DNA,连接酶及其应用,第三节,DNA,聚合酶及其应用,第四节 修饰性工具酶,Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer.,1,、大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,2,、,Klenow,片段,3,、,T4 DNA,聚合酶,4,、逆转录酶（反转录酶）,第三节,DNA,聚合酶及其应用,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的性质,纯化的,DNA,pol,I,由一条多肽链组成，约含,1000,个氨基酸残基，分子质量为,109kD,。每个大肠杆菌细胞中含有,400,个分子，在,37,条件下每分钟能催化,667,个核苷酸掺入正在生长的,DNA,链。,DNA,pol,I,在空间结构上近似球体，直径约,65,（,1=10,-10,m,）。在酶的纵轴上有一个约,20,的深沟（,cleft,），带有正电荷，这是该酶的活性中心位置。,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,（,E.Coli,DNA,pol,I,）是,Kornberg A. 1956,年首先从大肠杆菌,E.Coli,细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括,3,种不同的酶活力：,5- 3,聚合酶活性,以双链,DNA,为模板，催化单核苷酸结合到引物的,3,末端，并不断延伸。,5- 3,外切酶活性,将双链,DNA,中游离的,5,末端逐个切去。,3 - 5,外切酶活性,将游离的双链或单链,DNA,的,3,端降解。不过对于双链的降解可被,5-3,的多聚活性所抑制。,5,CCG,3,GGCTATCGGA,CCG,GGCTATCGGA,Pol I + Mg,2+,A,T,A,G,CCT,5,CCGATAGCCT,3,GGCTATCGGA,5,CCGATAGCCT,3,GGCTA,CCGATAGCCT,GGCTATCGGA,Pol I + Mg,2+,CCGATAGCCT,GGCTA,Pol I + Mg,2+,