大肠杆菌感受态细胞制备与转化

*,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,大肠杆菌感受态细胞制备与转化,【,实验原理,】,在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。,如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl,2,等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。,转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。其原理是细菌处于0的CaCl,2,低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细菌表面，经42短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。,转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。,CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存(半年)。,本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUCm-T质粒（T-载体）共保温，实现转化。由于pUCm-T质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUCm-T，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUCmT。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。,【设备、材料与试剂】,一、 设备,恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱， 恒温水浴锅， 制冰机， 分光光度计，微量移液枪。,二、 材料,E. coli DH5菌株: R,M,Amp；pUCmT质粒DNA: 购自上海生工生物工程有限公司。,三、试剂,【,实验步骤,】,一、 受体菌的培养,从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落,接种于20 ml LB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37振荡培养1-2小时至OD600 0.5左右。,二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法),1、将培养液转入离心管中,冰上放置10-30分钟，然后于4下5000 rpm离心10分钟。,2、 弃上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液30ml轻轻悬浮细胞，冰上放置10分钟后，4下5000 rpm离心10分钟，弃去上清。,3、每50 ml初始培养物用200 l预冷的0.1 mol/L的CaCl2 溶液重悬每份细胞沉淀，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。,三、 转化,1、取200l感受态细胞悬液，转移至无菌的微量离心管中，置冰上。2、加入连接产物10l，轻轻摇匀，冰上放置60分钟。3、42水浴中热击2分钟，热激后迅速置于冰上冷却2分钟。4、向管中加入800 l SOC液体培养基(不含Amp)，混匀后37振荡培养30分钟，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。（其间可以将IPTG 7l和X-Gal 40 l涂布于预制的Amp平板上）。,5、将上述菌液以3000 rpm离心20秒，弃大部分上清，用剩余的100l上清重悬菌体，涂布于含Amp的筛选平板上（已涂布IPTG 7l和X-Gal 40 l），正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37培养16-24小时。,同时做两个对照: 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5l 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。,附录：,LB液体培养基,：胰蛋白胨1 酵母提取物0.5 NaCl 1 用NaOH调pH至7.0，定容至1L，灭菌。,含Amp的LB固体培养基,：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。,【,注意事项,】,为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1、细胞生长状态和密度：最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。,2、质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。,3、试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。,4、防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。,【思考题】,1、如何正确地设置连接和转化的各种对照？其意义何在？,2、如何提高连接和转化的效率？,谢谢观赏,