2提质粒_XXXX年分子生物学实验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实 验 一,质粒DNA的提取及鉴定,1,背景理论知识,Section 1,2,掌握质粒信息和用途，学会自己看质粒图谱,掌握快速提取小量质粒DNA的方法,了解质粒DNA提取的基本原理,掌握琼脂糖凝胶电泳的方法,1.1.1,实 验,目 的,3,1.1.2 载 体,定义：基因工程中携带目的基因进入宿主 细胞进行扩增和表达的工具。,类型：大肠杆菌中的质粒、,噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体及动、植物病毒载体等。,4,载体的基本条件,复制子：一段具有特殊结构,的,DNA,序列，使与之结合的外源基因复制。,可检测的遗传表型：如抗药性、显色表型反应。,限制性内切酶的单一识别位点：便于外源基因的插入。,适合的拷贝数：较高的拷贝数不仅有利于载体的制备；使细胞中克隆基因的剂量增加。,1.1.2 载 体,5,质 粒 载 体,是,染色体外小型的双链环状的DNA，常用载体之一,自我复制,具有合适的限制酶切位点,筛选标记,可编码某些遗传性状 如抗药性、耐受重金属、产生细菌素等，被质粒转化的细菌也获得了额外的特性,高拷贝数,小分子量,1-200Kb,高稳定性,1.1.2 载 体,6,克隆载体,表达载体,原核,真核,穿梭载体,pGEM-T, pENTR,pET28a(+), pGEX, pMAL,pcDNA3.0,pEGFP-N3, pRK,质 粒 载 体 的分类,根据用途分类,1.1.2 载 体,7,质粒（原核载体）,1.1.2 载 体,8,1.1.2 载 体,9,质粒（真核载体）,1.1.2 载 体,10,1.1.3,质粒提取一般步骤,细菌培养物的生长,细菌的收获和裂解,质粒,DNA,的,纯化,11,质粒提取的常用方法,碱解法、,煮沸法,（cDNA、pDNA变性、复性不同）,苯酚抽提法,（酸性、低离子强度时超螺旋在水相分布）,CsCl法,（EB插入造成DNA浮力密度不同）,SDS 裂解法,（高盐浓度下大分子沉淀，质粒在上清）,玻璃纤维膜法,(试剂盒),1.1.3 质粒提取,12,碱裂解法提取质粒DNA,目的要求,通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术。,1.1.3 质粒提取,13,实验原理,根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。,在pH12.0-12.5，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。,当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等一起絮状沉淀下来而被除去。,碱裂解法提取质粒DNA,1.1.3 质粒提取,14,实验操作,Section 2,15,1.2.1,实验材料,含质粒载体（pET28a）和含目的基因质粒（pEGFP-N3）的大肠杆菌DH5a,溶液I,50 mmol/L 葡萄糖,5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris.HCl）（pH8.0）,10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8 .0）,溶液II,0.4 mol/L NaOH， 2% SDS,（用前等体积混合）,溶液III,5 mmol/L 乙酸钾 ， 冰乙酸 ，H,2,O,16,苯酚：氯仿,（25：24）,氯仿：异戊醇(,24：1),无水乙醇，,70%乙醇,(-20,C,保存),TE缓冲液,:,10mmol/L Tris.HCl, 1 mmol/L EDTA(pH8.0),胰RNA酶,1.2.1,实验材料,17,1.2.2 实验程序,任务分配：,A1和B1提取,pET28a,质粒,A2和B2提取,pEGFP-N3,质粒,18,1、细菌培养和收集,将,3ml,含,Kan,的,LB,液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，,37,振荡培养过夜。（已完成）,取,2.5mL,培养物倒入微量离心管（,EP,管）中, 10000rpm,离心,1min,，吸去培养液。,19,2、细菌裂解及质粒的提取,将细胞沉淀悬浮于,100ul,溶液,I,中,充分震荡混匀。,加,200ul,溶液,II,(,新鲜配制,),盖紧管盖,轻轻混匀,内容物,将离心管放,冰上,5min,。,加,150ul,溶液,III(,冰上预冷,),盖紧管口,轻轻颠倒,数次使混匀。,冰上,放置,5min,。,12000rpm,离心,10min,将上清转至另一,EP,管,（作好标记）,中。,1.2.2 实验程序,20,向上清中加入,等体积（,450ul,）,酚,:,氯仿,(1:1),（注意下层是有机相）,反复混匀。,12000rpm,离心,2,分钟,将上清,小心地,转移到另一离心管,（标记！）,中,加入,等体积（,450ul,）,氯仿,:,异戊醇,(24:1),反复混匀。,12000rpm,离心,2,分钟，,取上清液于新的,EP,管中。,3、质 粒 的 纯 化,1.2.2 实验程序,21,4、质粒的浓缩,加入,2,倍体积（,900ul,）无水乙醇,混匀后,室温放置,10min,。,12000rpm,离心,5,分钟，,倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。,用,1ml,70%,乙醇,洗涤质粒,DNA,沉淀,振荡并离心, 12000rpm,离心,2,分钟，倒去上清液,空气中干燥,5,10min,。,1.2.2 实验程序,22,5、质粒的溶解和保存,加,20ul TE,缓冲液,其中含有100ug/ml的胰RNA酶,使DNA完全溶解。,-20保存,。,1.2.2 实验程序,23,样品保存,1A,1,1A,2,1B,1,1B,2,2A,1,2A,2,2B,1,2B,2,3A,1,3A,2,3B,1,3B,2,4 5 6,7 8 9,10 11 12,13 14 15,1.2.2 实验程序,24,6、质粒DNA的电泳检测,（1）琼脂糖凝胶的制备,每,4,人,制备一块琼脂糖凝胶（,6,个泳道）,0.2,克琼脂糖,+20,毫升,TAE,缓冲液，电炉融胶（,充分溶解,），稍微冷却加,2,lgoldviewna,显示液，倒在电泳胶槽中，使胶凝固,(20min),。,1.2.2 实验程序,25,（2）,琼脂糖凝胶电泳,每人,1,个样品，,pET28a,或,pEGFP-N3,。,取,3,l,质粒,DNA+1.0,l,点样缓冲液，在,parafilm,膜上混匀后全部点至琼脂糖凝胶孔,（记住自己点样位置）,。,接通电泳仪和电泳槽的电源,(,注意正负极,),（,-,+,）,恒压,150V,电泳,10-20,分钟,紫外灯下观察并记录结果,(,对面实验室拍照片,),分析结果。,1.2.2 实验程序,26,负极,正极,1A,1,1A,2,1B,1,1B,2,2A,1,2A,2,2B,1,2B,2,Marker,1.2.2 实验程序,27,实验关键点,溶液,I,加入后充分悬浮,溶液,II,一次性加入后轻柔地颠倒混匀,溶液,III,加入后轻柔地颠倒混匀,酚抽提后小心吸取上清,无水乙醇和,70%,乙醇不要弄混,微量加样器的正确使用,28,移液器（排气式和排液式）,1选择一支量程合适的移液器,2设置移液量,3装枪头,4检验移液量,5吸取一定体积的液体,6目测吸入枪头的液体体积是否合理,7释放液体,8退下枪头,29,实验要求：,每人提取质粒2份（pET28a和pEGFP-N3各一份）,溶液每大组一套,枪每2人一套,Tips 2人一套（3盒）,30,思 考 题,分子生物学实验常用的载体有哪些？它们的特点是什么？,分离基因组,DNA,和质粒,DNA,有哪些不同之处？,核酸分离过程中，酚、氯仿、异戊醇的作用是什么？,在,TE,缓冲液中为什么要加入,EDTA,？,纯化的核酸如有酚和蛋白质的污染的话，对它的后期操作有何影响？,有哪些因素影响核酸的沉淀？,31,下 次 实 验,质粒DNA的酶切鉴定及电泳检测,32,开始工作吧！,LETS BEGIN NOW！,33,