实验三酵母核糖核酸RNA的提取

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验三,酵母菌,RNA,的提取、鉴定及定量测定,1,一、实验目的,掌握稀碱（,NaOH,）法分离酵母,RNA,的原理与方法,了解,RNA,的组分并掌握定性鉴定的具体方法。,2,二、实验原理,（一）目前常用的,RNA,的制备方法,浓盐法：是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。成本低、适于大规模操作。,稀碱法,:,是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀,RNA,。提取的,RNA,有不同程度的降解。稀碱法的提取时间短，提取率高于浓盐法，更利于工业化生产,。,3,（二）实验材料的选择,酵母细胞富含核酸，且核酸主要是,RNA,，含量为干菌体的,2.67%-10.0%,，而,DNA,含量较少，仅为,0.03%-0.516%,。为此提取,RNA,多以酵母为原料。,4,（三）,RNA,的化学组成的鉴定,（,1,）嘌呤碱鉴定：与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。,（,2,）核糖的鉴定：地衣酚（,3,5,二羟甲苯试剂）显色法,（,3,）磷酸的鉴定：与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀,(NH,4,),3,PO,4,12MoO,3,。,（,4,）脱氧核糖的鉴定：与二苯胺试剂反应生成蓝灰色沉淀，如没有沉淀产生，说明没有,DNA.,5,三、试剂,1.,干酵母粉。,2,0.04mol,氢氧化钠溶液。,3,乙酸。,4,95,乙醇。,5,5,硫酸。,6.,浓氨水。,7. 50g/L,硝酸银溶液。,6,8,地衣酚（,3,5,二羟甲苯试剂）：取比重,1.19HCl 100ml,，加入,FeCl,3,6H,2,0 100mg,及二羟甲苯,100mg,，混匀溶解后，置于棕色瓶中，此试剂必须在临用前新鲜配制。市售的,3,5,二羟甲苯不能使用，必须用苯纯化结晶,l,2,次，并用活性炭脱色方可使用。,9,定磷试剂：,2.5,钼酸铵溶液：,20ml,水溶解,2.5,克钼酸铵，加,5mol,L H,2,S0,4,30ml,，用水稀释至,l00ml,，此试剂可在冷处保存一月不变质。,7,10.,10,抗坏血酸,(Vc),溶液：,10g,抗坏血酸溶于,100ml,水。贮棕色瓶中。溶液呈淡黄色尚可用，如呈深黄色即失效。,11,二苯胺试剂： 称取,1.5g,二苯胺（如不纯，须在,70,乙醇中重结晶,2,次），溶于,100ml,冰醋酸（,AR,）中，再加入浓,H,2,SO,4,1.5ml,， 摇匀，贮在棕色瓶中放冰箱内保存备用。,12,沉淀剂,(,钼酸铵,过氯酸试剂,),：,0.25,钼酸铵溶于,2.5,过氯酸中。如配,200ml,，即在,193ml,水中加入,7m170,过氯酸和,0.5g,钼酸铵。,8,四、操作步骤,1.,核酸的提取：,每二人用大试管取,1g,干酵母,加入,0.05mol NaOH,溶液,5ml,提取，放入试管沸水浴加热,30,分钟，并经常搅拌。,待冷却后加入乙酸,5,8,滴，使提取液呈酸性,(,石蕊试纸,),，移在离心管里，离心,10,分钟,(3500,转分,),。,将上清液倒入另一离心管中，加入,95,乙醇,2ml,，边加边搅。加毕，离心,10,分钟，即可得到核酸钠的白色沉淀。,9,2.,核酸的水解,：,在含有核酸钠的离心管中加入,5,硫酸,2ml,，用玻棒搅匀，沸水浴煮,10,分钟。,其中,1ml,水解液放进,EP,管里，贴好标签冷冻保存（下次试验用）,10,3.,核酸的鉴定,取水解液，按下表所列程序分别鉴定核酸的嘌呤碱、磷酸及核糖和脱氧核糖。,11,1.,嘌呤碱的鉴定：,取试管两只，分别标明测定管与对照管，依次加入下列各试剂。,管号,RNA,水解液,5,H,2,SO,4,浓氨水,50g,L AgNO,3,测定管,0.2ml,不加,5,滴使成碱性,5,滴,对照管,不加,0.2ml,5,滴使成碱性,5,滴,注：加浓氨水使呈碱性可用,pH,试纸检定。,加入,AgNO,3,后，观察有何变化。静置,15,分钟后，再比较两管中之沉淀。,12,2.,磷酸的鉴定：,取试管两只，分别标明测定管与对照管，然后依次加入下列各试剂：,管号,RNA,水解液,5,H,2,SO,4,钼酸铵试剂,V,C,测定管,0.2ml,不加,5,滴,5,滴,对照管,不加,0.2ml,5,滴,5,滴,放置数分钟，观察两管颜色有何不同。,磷酸,+,钼酸铵,磷钼酸,+Vc,钼蓝,13,3.,核糖的鉴定：,取试管两只，分别标明测定管与对照管，然后依次加入下列各试剂。,管 号,RNA,水解液,5,H,2,SO,4,3,，,5-,二羟甲苯,测定管,4,滴,不加,6,滴,对照管,不加,4,滴,6,滴,将两试管放入沸水浴内,加热,10,分钟,，比较两管之颜色。,14,4.,脱氧核糖的鉴定,：取两试管分别标明测定管与对照管，然后依次加入下列各试剂。,管 号,RNA,水解液,5,H,2,SO,4,二苯胺,测定管,4,滴,不加,6,滴,对照管,不加,4,滴,6,滴,将两试管同时放入沸水浴内，,加热,10,分钟,后，比较两管之颜色。,15,思考题,1.,核酸的溶解性质是什么,?,常用什么试剂分离沉淀核酸,?,2.,为什么用酵母作为实验原料？如何使,RNA,从酵母中释放出来？,3.,破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行,?,16,实验五,RNA,的定量测定,紫外,(UV),吸收法,17,一、目的要求,1.,掌握紫外线（,UV,）吸收法测定核酸浓度的原理。,2.,熟悉紫外分光光度计的使用方法。,18,二、实验原理,核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收,UV,的性质，其吸收高峰在,260nm,波长处。测得未知浓度核酸溶液的,A260nm,值，即可以计算出其中,RNA,或,DNA,的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。,19,三、,试剂,钼酸铵过氯酸沉淀剂：取,3.6ml 70%,过氯酸和,0.25g,钼酸铵溶于,96.4ml,蒸馏水中，即成,0.25%,钼酸铵,2.5%,过氯酸溶液。,20,四、操作步骤,（,1,）取,0.5ml,未知浓度的,RNA,溶液（上次实验提取），用蒸馏水稀释至,50ml,，此为,A,液。,（,2,）取,A,液,2ml,，再稀释至,50ml,，为,B,液。,（,3,）另取,4ml A,液，加,1ml,沉淀剂，摇匀后置冰水中,20,分钟，离心（,3500rpm/min,，,10,分钟），取上清液,2.5ml,，稀释至,50ml,，此为,C,液。,沉淀剂的作用是，使,RNA,沉淀析出，得到不含,RNA,的对照液。,（,4,）分别取,B,，,C,液于厚度为,1cm,的石英比色杯，在,260nm,波长处测定,A,值。,21,式中,A,260,为,B,管稀释液在,260nm,波长处,A,值减去,C,管稀释液在,260nm,波长处,A,值。,N,为稀释倍数,.,0.024,（或,0.020,）表示,1,m,g/ml RNA,（或,DNA,）溶液测定的,A260,值相当于,0.024,。此为多次试验验证的数值。,计算,1000,22,思考题,1.,核酸的溶解性质是什么,?,常用什么试剂分离沉淀核酸,?,2.,为什么用酵母作为实验原料？如何使,RNA,从酵母中释放出来？,3.,破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行,?,23,实验六 过氧化氢酶米氏常数（,K,m,）的测定,24,一、实验目的,学习米氏常数的测定方法。,25,二、实验原理,米氏常数的测定,米氏常数的测定：双倒数作图法（,Lineweaver-Burk,法）,1,Km,1 1, = . + ,v Vmax,S,Vmax,26,二、实验原理,本实验测定红细胞中过氧化氢酶的米氏常数。过氧化氢酶,(CAT),催化下列反应：,2H,2,O,2,CAT,2H,2,O+O,2,H,2,O,2,浓度可用,KMnO,4,在硫酸存在下滴定测知。,2KMnO,4,5H,2,O,2,3H,2,SO,4,- 2MnSO,4,K,2,SO,4,5O,2,8H,2,O,求出反应前后,H,2,O,2,的浓度差即为反应速度。作图求出过氧化氢酶的米氏常数。,27,三、试剂,1,0.05mol/L,草酸钠标准液 将草酸钠（,AR,）于,100,105,烘,12h,。冷却后，准确称取,0.67g,，用水溶解倒入,100ml,量瓶中，加入浓,H,2,SO,4,5ml,，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。,2,约,0.02ml KMnO,4,储存液 称取,KMnO,4,3.5g,，溶于,1000ml,蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。,3,0.004mol/L KMnO,4,应用液 取,0.05mol/L,草酸钠标准液,20ml,，于锥形瓶中，加浓,H,2,SO,4,4ml,，于,70,水浴中用,KMnO,4,贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出,KMnO4,贮存液的标准浓度，稀释成,0.004mol/L,，每次稀释都必须重新标定储存液。,4,约,0.08mol/L H,2,O,2,液 取,20%H,2,O,2,（,AR,）,40ml,于,1000.0ml,量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用,0.004mol/L KMnO4,标定之，稀释至所需浓度。,5,0.2mol/L,磷酸盐缓冲液（,pH7.0,）。,28,四、操作步骤,l,血液稀释：,吸取新鲜（或肝素抗凝）血液,0.1ml,，用蒸馏水稀释至,10ml,，混匀。取此稀释血液,1.0ml,，用磷酸盐缓冲液,(pH7.0,，,0.2mol/L),稀释至,10ml,，得,1,：,1000,稀释血液。,2,H,2,O,2,浓度的标定,：取洁净锥形瓶两只，加浓度约为,0.08mol/L,的,H,2,O,2,2.0ml,和,25%H,2,SO,4,2.0ml,，分别用,0.004mol/L KMnO,4,滴定至微红色。从滴定用去,KMnO,4,ml,数，求出,H,2,O,2,的,mol,浓度。,29,3,反应速度的测定：,取干燥洁净,50ml,锥形瓶,5,只，编号，按下表操作。,将各瓶置,37,水浴预热,5min,，依次加入,1,：,1000,稀释血液每瓶,0.5ml,，边加边摇，继续保温准,5min,，按顺序向各瓶加,25%H,2,SO,4,2.0ml,，边加边摇，使酶促反应立即终止。,最后用,0.004mol/L KMnO,4,滴定各瓶至微红色,记录,KMnO,4,消耗量,(ml),。,加入物,(ml),1,2,3,4,5,H,2,O,2,(,约,0.08mol/L),0.50,1.00,1.50,2.00,2.50,蒸馏水,3.0,2.50,2.00,1.50,1.00,30,五、计算,1,（式中：,4,为反应液量,4ml,）,2,反应速度的计算：以反应消耗的,H,2,O,2,mmol,数表示。,反应速度,=,加入的,H,2,O,2,mmol,数剩余的,H,2,O,2,mmol,数,剩余的,H,2,O,2,mmol,数：,KMnO,4,0.005 mol/L,消耗的,KMnO,4,毫升数, 5/2,（式中：,5/2,为,KMnO4,与,H,2,O,2,反应中,mol,换算系数）,3,求,Km,值：实验测得的结果，以,1/v,对,1/S,作图，求出,V,和,Km,的数值。,0.004,31,实验七 维生素,C,的定量测定,2.6- DCPIP,（,2.6-,二氯酚靛酚）滴定法,32,一、实验目的,1.,学习并掌握定量测量维生素,C,的原理和方法。,2.,熟练微量滴定法的基本操作。,33,二、实验原理,维生素,C,是人类营养中最重要的维生素之一，根据它具有的还原性质可以测定维生素,C,的含量。常用的测定方法有,（,1,）,2,，,6-DCPIP (,Dichlorophenolindo phenol,),（还原型,VC,）,（,2,）,2,，,4-,二硝基苯肼法 （总,VC,）,（,3,）碘酸法,（,4,）碘量法,（,5,）荧光分光光度法,34,35,三、试剂及仪器,（一）试剂及材料,（,1,）松针,（,2,）酸化蒸馏水,（,3,）,2,，,6,DCPIP,；将,50mg,2,，,6,DCPIP,溶解于约,200ml,含有,52mg,碳酸氢钠的热水中。冷后稀释至,250ml,。装入棕色瓶内。放在 冰箱里保存。,2,，,6,DCPIP,不稳定,每周必须重新配制，使用前需按照下法标定：,取,5ml,标准抗坏血酸溶液加,5ml,1,草酸，以,2,，,6,DCPIP,滴定呈粉红色，并在,15,秒钟内不退色为终点。计算,2,，,6,DCPIP,溶液的浓度。,（,4,）标准抗坏血酸溶液：溶解,100mg,纯抗坏血酸粉状结晶于,1,草酸中，然后稀释到,500ml,。 使用前临时配制。,（二）器材,（,1,）锥形瓶（,50ml,）（,2,）小研钵（,3,）吸量管（,10ml,）（,4,）漏斗（,5,）滤纸（,6,）容量瓶（,50ml,）（,7,）微量滴定管（,5ml,）,36,四、操作步骤,1.,准确称取松针约,1g,。样品必须用温水洗去泥土，并在空气中风干。放入研钵中，加,1g,石英砂，再加酸化蒸馏水,5,10ml,一起研磨。,2.,离心（,3500,转,/,分）,10,分钟，将上清液移入容量瓶，用酸化蒸馏水定容至,50ml,。,3.,取,10ml,上述溶液放入小锥形瓶内，用微量滴定管，以,2,，,6,DCPIP,（蓝色）滴定至提取液呈现淡粉红色，并保持,15,30,秒不褪。,(,滴定过程必须迅速，不要超过,2min,。因为在本滴定条件下，一些非维生素,C,还原物质的还原作用较迟缓，快速滴定右以避免或减少它们的影响,),4.,另取,10ml,酸化蒸馏水作空白对照滴定。,提取液和空白对照各做三份，对结果取平均值进行计算,37,五、计算,式中：,V,A,为滴定样品提取液所耗用的,2,，,6,DCPIP,的平均毫升数；,V,B,为滴定空白对照所耗用的,2,，,6,DCPIP,的平均毫升数；,C,为样品提取液的总毫升数；,D,为滴定时所取的样品提取液毫升数；,W,为被检样品的质量。,T,为,1ml,标准,0.001N 2,，,6,DCPIP,溶液相当维生素,C,的毫克数，,T,的具体数目为,0.088mg/ml,。,38,思考题,为了准确测得维生素,C,含量，实验过程中都应注意哪些操作步骤？为什么？,39,实验八 血糖的定量测定（,GOD-PAP,法）,40,一、实验目的,学习GOD-PAP法测定血糖含量的原理和方法。,41,二、实验原理,动物血液中的糖主要是葡萄糖，正常情况下，其含量较恒定。健康动物血糖水平为,80-120mg/100ml,。,GOD-PAP,法，即过氧化物酶,-,抗过氧化物酶法是近几年临床血糖定量测定的普遍方法。该法测定血糖依据的酶反应为：,葡萄糖,+O,2,+H,2,O =,葡萄糖酸,+H,2,O,2,2H,2,O,2,+4-,氨基安替比林,+,酚,=,醌亚胺,+4H,2,O,醌亚胺在,A480nm-A550nm,波长有最大吸收，所产生颜色的深浅与血清中葡萄糖的量成正比。在同样条件下，测定葡萄糖标准液和样品的吸收值，代入后面所给公式即可求出样品中葡萄糖的含量,。,42,三、试剂及仪器,1.,血糖试剂盒,酶试剂（,GOD,，,PAP,，磷酸盐，酚，,4-,氨基安替比林）,100mg/dL,血糖标准溶液,2.,兔血清,43,四、操作步骤,取,3,只试管，按下列加入试剂,空白 标准 样品,酶制剂,3.00ml 3.00ml 3.00ml,蒸馏水,0.02ml - -,葡萄糖标准溶液,- 0.02ml -,样品,- - 0.02ml,分别将各管溶液摇匀，,37,度保温,15,分钟，,505nm,波长比色。,44,五、计算,C,样品,= (A,样品,/A,标准,),x C,标准,45,实验九 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较,46,一、实验目的,1,学习分光光度计的原理和使用方法。,2,学习测定淀粉酶活力的方法。,3,了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。,47,二、实验原理,种子中贮藏的碳水化合物主要以淀粉的形式存在。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。,淀粉的水解产物麦芽糖有还原性,能与,3,5-,二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色,3-,氨基,-5-,硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。,48,三、试剂及仪器,（一）器材,1,25,毫升刻度试管。,2,吸管。,3,乳体。,4,离心管。,5,分光光度计。,6,离心机。,7,恒温水浴。,（二）试剂,1. 0.1,标准麦芽糖溶液,20,毫升：精确称量,100,毫克麦芽糖，用少量水溶解后，移入,100ml,容量瓶中，加蒸馏水至刻度。,2,pH 6.9,，,0.02,摩尔,L,磷酸缓冲液,100,毫升,3,l,淀粉溶液,100,毫升：,1,克可溶性淀粉溶于,100,毫升,0.02,摩尔,L,磷酸缓冲液，其中含有,0.006,摩尔,L,氯化钠。,4,l,3,5-,二硝基水杨酸试剂,: 1g 3,5-,二硝基水杨酸溶于,20,毫升,2,摩尔,L,的氢氧化钠溶液和,50,毫升水中；再加人,30,克酒石酸钾钠，定客至,100,毫升。若溶液混浊，可过滤。,5,l,氯化钠溶液,300,毫升,49,四、操作步骤,1,种子发芽：,小麦种子浸泡,2.5,小时后，放人,25,恒温箱内或在室温下发芽。,2,酶液提取：,取发芽第三天或第四天的幼苗,15,株，放人乳钵内，加海砂,0.2g,，加,1,NaCI,溶液,10,毫升，用力磨碎。在室温下放置,20,分钟，搅拌几次。将提取液离心（,l500,转,min,）,10,分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，将酶提取液稀释,10,倍。,取干燥种子,15,粒作为对照（提取步骤同上）。,50,四、操作步骤,3,酶活力测定：,（,1,）取,25,毫升刻度试管,4,支。编号。按下表要求加人各试剂（各试剂须,25,预热,10,分钟）。,将各管混匀，放在,25,，水浴中保温,3,分钟后，立即向各管中加人,1,3,5-,二硝基水杨酸溶液,2,毫升。,（,2,）取出各试管，放人沸水浴中加热,5,分钟。冷至室温，加水稀释至,25,毫升。将各管充分混匀。,（,3,）用空白管作对照；在,500nm,处测定各管的光吸收值,.,51,五、计算,根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，,即：A标准A未知C标准C未知,则,CA酶C标准A标准,总活力单位= C酶N酶V酶,N为酶液的稀释倍数,V为测量后酶液的总体,52,