实验十七2烟草原生质体融合

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验十七,（,2,）烟草原生质体融合,一、原理,PEG,带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。在邻近原生质体表面之间起着分子桥的作用，加上,PEG,渗透吸水的作用，使原生质体相互接触在一起。,在洗涤过程中，直接或间接与质膜结合的,PEG,分子从原生质体表面洗脱，并随着,pH,的降低，导致膜电荷的不平衡和发生重新分布；在原生质体 吸水过程中，发生原生质体融合。,1,二、实验目的,学习植物原生质体融合的方法，为进行体细胞杂交，培育体细胞杂种和胞质杂种打下基础。,三、实验材料和用具,1,、材料：烟草,BY2,愈伤组织，烟草组培苗,2,、用具,：,过滤器，注射筒，不锈钢网筛（,=54m,），漏斗，三角瓶，滴管，,10ml,刻度离心管，血球记数板。,2,四、实验步骤,1,、配制酶液,各组（,2,人）配制下列酶液各,10ml,，,4000rpm,离心,6min,后过滤灭菌于无菌三角瓶中。,CPW,培养基,+0.4mol/L,甘露醇,+,2%,纤维素酶,+,0.5%,离析酶,3,2,3,周龄愈伤组织和叶片各约,1g,和,0.5g,，叶片剪成细条,加入到酶液中、用镊子分散愈伤组织,黑暗、,25,酶解,56,小时，间歇轻轻摇动。,2,、,BY2,愈伤组织和叶肉原生质体分离,4,3,、过滤和离心洗涤原生质体,过滤,800rpm,离心,3min,弃上清液,加入,3ml CPW,培养基，用滴管重新悬浮原生质体,800rpm,离心,3min,弃上清液,重新悬浮在,0.5ml CPW,溶液中,5,4,、原生质体融合,（,1,）调整密度：用血球板计数后，将原生质体的密度调整为,10,6,个原生质体,/ml,。,（,2,）配置,PEG,融合液（无菌下）,PEG,溶液：甘氨酸缓冲液：,DMSO=8,：,1,：,1,（,3,）将愈伤组织原生质体和叶肉原生质体等体积混合。,6,（,4,）原生质体融合步骤,取,0.2ml,混合原生质体悬浮液,加入,0.2ml,高钙高,pH PEG,融合液,静置,10min,5min,内缓慢加入,5ml W,5,稀释液，轻轻吸打混匀,静置,30min,800rpm,离心,3min,，弃上清夜,重新悬浮在,0.5ml W,5,，,静置,10min,7,（,5,）融合原生质体的观察,吸,1,滴融合的原生质体悬浮液于血球计数板上，在显微镜下融合的原生质体，统计融合率。,融合原生质体的特征：,A,：异源融合；,B,：同源融合,融合率,=,融合的原生质体数,/,观察的原生质体数,8,准备下次实验的试剂（各,100ml,）：,（,1,）,2CTAB,提取缓冲液：,100mM Tris-HCl,（,pH8.0,），,2,（,w/v,）,CTAB,，,1.4M NaCl,，,40mM,-,巯基乙醇，,20mM EDTA,（,2,）,TE,缓冲液：,10mM Tris-HCl (pH7.4), 1mM EDTA,。,（,3,）,50,TAE,电极缓冲液：称取,24.2gTris,溶解于适量蒸馏水中，加入,5.7ml,冰乙酸，,10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0),溶液，,定容到,100ml,。,（,4,）溶液,I：50 mmol/L,葡萄糖,，25,mmol/L Tris.HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0）,（,5,）溶液,III,：,60 ml 5mol/L,乙酸钾, 11.5 ml 11.5,冰乙酸, 28.5 ml,无菌水,（,6,）分别配制,0.4 mol/L NaOH,和2,SDS,溶液（,各50,ml,）,9,