PCR-RFLP 基因分型方法——北大课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR-RFLP,基因分型方法,-,关于序列查找、引物设计和酶切位点分析,概念,聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析,限制性片段长度多态性,(,restrition,fragment,length,polymophism,，,RFLP,):,是指由限制性酶切位点间的插入,缺失,重排或,点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。,PCR-RFLP:,是在,PCR,和,DNA,序列分析基础上产生的,RFLP,技术。该方法是通过,PCR,扩增一段,DNA,片段，然后再选择适当的限制性内切酶，消化,PCR,产物，经电泳，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。,概念,概念,确定基因序列,设计引物,选择内切酶,电 泳,基 因 型,Step by step,基因序列查找,http:/,www.genomatix.de,/,http:/,www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank,http:/,expasy.org/sprot,/,http:/,www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt,/,基因序列查找,选择,gene,输入基因名称,基因序列查找,基因的全称,基因的物种来源,引物设计,引物设计,引物一般原则,基本原则：,1.,引物要跟模板紧密结合，,2.,引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，,3.,引物不能在别的非目的位点引起,DNA,聚合反应（即错配）。,需要考虑的因素：,引物长度,（,primer length,）、,产物长度,（,product length,）、,序列,Tm,值,(melting temperature),、,G,值,(internal stability),、,引物二聚体及发夹结构,（,duplex formation and hairpin,）,错误引发位点,（,false priming site,）、,引物及产物,GC,含量,（,composition,）,引物一般原则,引物的长度：,15-30,bp,，常用的是,18-27,bp,太短：,特异性不好,太长：,延伸温度大于,Taq,酶的最适温度,引物末端要求：,3,端的序列要比,5,端重要，,引物,3,端的碱基一般不用,A,A,在错误引发位点的引发效率相对比较高 ，,5,端序列对,PCR,影响不大，常用来引进修饰位点或标物。,引物的,GC,含量 ：,一般为,40-60%,，,以,45-55,为宜,两条引物之间的,GC,含量不宜相差太大,引物一般原则,Tm,值：,尽量保证两条引物的,Tm,值相匹配。最,好相差,不要大于,5,度,引物二聚体及发夹结构的能量：,绝对值一般不要超过,4.5,最好不要位于,3,末端,否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致,PCR,正常反应不能进行 ，如果在,5,末端对反应就没有多大的影响了,G,值,:,反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的,G,值最好呈正弦曲线形状，即,5,端和中间,G,值较高而,3,端,G,值相对较低，且不要超过,9,。如此则有利于正确引,发反应而可防止错误引发,PCR-RFLP,引物特殊要求,PCR,产物的长度：,200-1000bp,酶切后产物片断的大小差距：,100bp,以上,引物设计,工欲善其事，必先利其器,Primer Premier 5.0,引物设计,Oligo,6.0,引物评价,引物设计,新建窗口,输入序列,Primer Premier 5.0,突变位点,选取突变位点前后约,500bp,长度的碱基,Primer Premier 5.0,引物设计,酶切位点分析,Primer Premier 5.0,自动搜索引物,手动编辑引物,Primer Premier 5.0,前引物的位置（必须超过突变位点）,后引物的位置（必须在突变位点之后）,PCR,产物的长度,引物的长度,Primer Premier 5.0,引物的综合评分，分越高引物越好,引物的详细信息,引物序列,Primer Premier 5.0,发夹结构,二聚体,错配,交叉二聚体,Primer Premier 5.0,更高级应用：,参数的设置,手动搜索或者修改引物,搜索特殊引物（比如单条引物的搜索等）,引物纯化方式的选择,去盐（,RPC,、,Desalted,）纯化,它是一种对,DNA,有特异性的吸附的树脂，能有效地去除,盐分及小片段的,DNA,分子。这种引物可以用于,常规,PCR,、,DNA,测序,等实验。,PAGE,纯化,PAGE,纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对,DNA,片段进行分离，然后从凝胶中回收目的,DNA,的方法。,PAGE,纯化法也是一种非常有效的,DNA,纯化方法，纯化 后的纯度,大于,95%,，对长链,OligoDNA,(,大于,50mer),的纯化特别有效。,适用于,PCR,用引物,(,如定点诱变引物,),，,DNA,测需用引物，,各种探针等,。,HPLC,纯化,采用高效液相色谱纯化，产物纯度极高，可达,99%,。,适用于各种基因工程试验，特别是：,荧光标记,DNA,、,长链,DNA,、,PCR,克隆，定点突变，人工合成基因等,。,几种特殊类型的引物设计,引入酶切位点引物设计,Takara,定点诱变试剂盒 定点诱变引物设计,Quikchange,定点诱变试剂盒 定点诱变引物设计,引入酶切位点引物设计,为什么要引入酶切位点？,突变位点没有内切酶或者合适的内切酶,通过人为的在引物上改变一个碱基从而使之与突变位点的碱基构成新的酶切位点,引入酶切位点引物设计,tctcaacaaaa,T,caaaactgtaag,突变位点，找不到合适的内切酶,tctcaaca,G,aa,T,caaaactgtaag,Hinf,I,可以使用,PCR-RFLP,的方法基因分型,引入酶切位点引物设计,基本原则：,人为改变原序列上的一个碱基从而与突变位点的碱基构成新的合适的酶切位点,具体要求：,内切酶的选择：便宜、条件稳定和常用。,引物的位置：引物,3,端的最后一个碱基一定不能超过突变位点,改变酶切位点的位置：尽量远离突变位点，最好不要紧邻突变位点，一般相隔,2-3,个碱基,引物的长度：在保证引物质量的前提下，尽可能的加长引物的长度。最好不要小于,20bp,引入酶切位点引物设计,5. PCR,产物的长度：最好能位于,100-200bp,之间，琼脂糖凝胶电泳时更好区分。,6.,突变位点附近的引物设计受限，因此，另外一条引物应该尽量设计好。,7.,在有多种内切酶可供选择时，尽量选择切频率高的基因型的内切酶。以提高灵敏度。,定点诱变引物设计（一）,定点诱变引物设计（一）,定点诱变引物设计（二）,5-ggattcagaatgattctctcc,a,agaaaacatcctttttggatg-3,3-cctaagtcttactaagagaggttcttttgtaggaaaaacctac-5,酶切位点分析,新建窗口,酶切位点分析,输入序列，注意粘贴的序列不能有空格和段落标记符号,大写突变位点以便于辨认,酶切位点分析,选择菜单,Analyze,Restriction,maping,酶切位点分析,酶谱选择,点击确定,酶切位点分析,可供选择的限制性内切酶,酶切位点分析,酶切位,点个数,酶切位置,酶切后片断大小,电泳,琼脂糖凝胶电泳,：操作简便、快捷、灵敏。是分离、鉴定和纯化核酸的首选的标准方法。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,：分辨力高于普通琼脂糖凝胶电泳，适用于低分子质量蛋白、寡核苷酸的分离和,DNA,序列的分析。,电泳,琼脂糖凝胶浓度（,%,）,线性,DNA,分子大小（,kb,）,0.3,5-60,0.6,1-20,0.7,0.8-10,0.9,0.5-7,1.2,0.4-6,1.5,0.2-4,2.0,0.1-3,凝胶浓度和,DNA,分子的有效分离范围,电泳,157bp,132bp,344bp,310bp,相差,25bp,相差,34bp,结果分析,频率统计,H-W,平衡分析,统计检验,最终结果,祝大家实验顺利,