重组DNA技术与基因工程-张惠展(第4部分,共4部分)

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,重组,D,NA,技术与,基因工程,5,2,3,4,1,6,7,8,9,重组,DNA,技术与基因工程的基本概念,重组,DNA,技术与基因工程的基本原理,重组,DNA,技术所需的基本条件,重组,DNA,技术的操作过程,目的基因的克隆与基因文库的构建,外源基因在大肠杆菌中的表达,外源基因在酵母菌中的表达,外源基因在哺乳动物细胞中的表达,外源基因表达产物的分离纯化,A,高等哺乳动物基因工程的基本概念,8,外源基因在哺乳动物细胞中的表达,高等哺乳动物基因工程,高等哺乳动物细胞基因表达技术,高等哺乳动物转基因技术,转基因动物个体,动物工程细胞,哺乳动物遗传性状改良,药物筛选研究评价模型,人体基因治疗,蛋白多肽物质大规模生产,药物筛选研究评价模型,B,高等哺乳动物的受体系统,8,外源基因在哺乳动物细胞中的表达,高等哺乳动物细胞的生长特性,高等哺乳动物受体细胞的条件,高等哺乳动物受体细胞的遗传标记,常用的高等哺乳动物受体细胞,高等哺乳动物细胞的生长特性,正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：,锚地依赖性：,细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂,血清依赖性：,细胞必须具有生长因子才能生长,接触抑制性：,细胞与细胞接触后，生长便受到抑制,形态依赖性：,细胞称扁平状，并有长纤维网状结构,上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活,50,代,且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞,会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状,态称为,细胞系形成,，此时的细胞成为,细胞系,。,高等哺乳动物受体细胞的条件,以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件,细胞系特征,丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大,遗传稳定性,外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存,合适的标记,便于转化株的筛选和维持,生长快且齐,分裂周期短，生长均一，便于控制,规模培养,大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能,安全性能好,不合成分泌致病物质，不致癌,满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。,高等哺乳动物受体细胞的遗传标记,营养缺陷型的哺乳动物受体细胞,5-磷酸核糖-1-焦磷酸（,PRPP）,次黄嘌呤核苷一磷酸（,HMP）,次黄嘌呤核苷（,HR）,GMP,AMP,尿嘧啶核苷一磷酸（,UMP）,胸腺嘧啶核苷一磷酸（,TMP）,胸腺嘧啶核苷（,TR）,嘌呤核苷酸生物合成途径,嘧啶核苷酸生物合成途径,次黄嘌呤磷酸,核糖转移酶,（,HPRT）,（,TK）,胸腺嘧啶,核苷激酶,氨基喋呤（,AP）,氨基喋呤（,AP）,从头合成途径,补救合成途径,高等哺乳动物受体细胞的遗传标记,营养缺陷型的哺乳动物受体细胞,含有胸腺嘧啶核苷激酶（,TK,）,编码基因缺陷的受体细胞（,tk,-,）,不能在含有,次黄嘌呤核苷,、,氨基喋呤,、,胸腺嘧啶核苷,的培养基,上（,HAT,培养基,）生长，载体上的标记基因,tk,能与之遗传互补,含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（,HPRT,）,编码基因缺陷的受体细胞,不能在含有,次黄嘌呤核苷,、,氨基喋呤,、,胸腺嘧啶核苷,的培养基,上（,HAT,培养基,）生长，载体上的标记基因,hprt,与之遗传互补,（,hprt,-,）,高等哺乳动物受体细胞的遗传标记,哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记,遗传标记,编码产物,筛选药物,作用机理,APH,-,氨基糖苷磷酸转移酶,G418,APH,灭活,G418,DHFR,二氢叶酸还原酶,氨甲喋呤,DHFR,变体抗氨甲喋呤,HPH,-,潮霉素,B,磷酸转移酶,潮霉素,B,HPH,灭活潮霉素,B,TK,-,胸腺嘧啶核苷激酶,氨基喋呤,TK,合成,TMP,XGPRT,-,黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,霉酚酸,XGPRT,合成,GMP,ADA,-,腺嘌呤核苷脱氨酶,腺嘌呤木酮糖苷,ADA,灭活,Xyl,-A,常用的高等哺乳动物受体细胞,迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产,的高等哺乳动物受体细胞主要还是,中国仓鼠卵巢细胞,（,CHO,），,其优,势有如下几个方面：,遗传背景清楚，生理代谢稳定,与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确,基因转移和载体表达系统完善,耐受剪切力，便于大规模培养,被美国,FDA,确认为安全的基因工程受体细胞（,GRAS,）,C,高等哺乳动物的载体系统,8,外源基因在哺乳动物细胞中的表达,人腺病毒,DNA,猴空泡病毒,DNA（SV40）,人乳多瘤病毒,DNA（BKV）,人牛痘病毒,DNA,人腺病毒,DNA,腺病毒科为线状双链,DNA,病毒，无包膜，呈二十面体，共有,93,个,成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒,腺病毒的生物学特性,有,6,个亚属，其中常用来构建载体的主要是,C,亚属的,2,型（,Ad2,）,和,5,型,（,Ad5,）,病毒。,腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，,绝大多数的腺病毒成员均能致癌。,人腺病毒,DNA,腺病毒的基因组,DNA,ITR,ITR,E1,E2,E3,E4,IVa2,VA,L1,L2,L3,L4,L5,腺病毒基因组,DNA,全长,36,kb,，,其包装上限为原基因组的,105%,，,DNA,两端各有,一个反向重复序列（,ITR,）；,E1-E4,为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的,表达调控有关，其中,E3,编码晚期基因的调控因子，,L1-L5,为编码病毒包装蛋白的晚期,基因；,IVa2,和,VA,均为病毒,RNA,聚合酶的亚基编码基因。,E3,区缺失只会影响病毒颗粒,的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个,2.2,kb,的片段,，,使得载体的装载量提高到,4,kb,以上。,人腺病毒,DNA,基因重排低,外源基因与病毒,DNA,重组后能稳定复制几个周期,腺病毒,DNA,载体的特点,安全性能好,不整合人的染色体,DNA,，,不会导致恶性肿瘤,宿主范围广,对受体细胞是否处于分裂期要求不严格,使用效果好,外源基因在载体上容易高效表达,猴多瘤病毒,DNA（SV40）,SV40,属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由,VP1、,VP2,、,VP3,三种衣壳蛋白包装而成，基因组为,5224,bp,的双链环状,DNA,SV40,的生物学特性,SV40,可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白,H2、H3、H4,结合，从,而使其,DNA,形成类似核小体的,微型染色体,结构。,SV40,感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，,便发生,非同源整合,而致癌。,猴多瘤病毒,DNA（SV40）,SV40,的基因组,DNA,t,/,T,基因编码病毒的小抗原和大,SV40 DNA,ori,VP2,T,VP3,VP1,t,抗原与病毒的致癌作用密切相关,SV40,在裂解宿主细胞前的晚期,状态时，每个,宿主细胞含有,105,个病,毒,DNA,拷贝，因此十分适合用于高效,表达外源蛋白,猴多瘤病毒,DNA（SV40）,SV40 DNA-,质粒,DNA,杂合载体的构建,重组的,SV40 DNA,分子必须经过,包装后才具有感染能力，因此插入的,外源,DNA,片段不能太大。为了尽量提,高,SV40,的装载量，必须删除一些基因,片段，因此重组的,SV40,分子必须与野,生型病毒共感染受体细胞，才能形成,有感染力的重组病毒颗粒。,Ap,r,ori,viral gene,gpt,SV40,ori,pV2-GPT,pBR322,pBR322,SV40,pV2-GPT,是一种,SV40 DNA,与大肠杆菌质粒,DNA,杂合的载体，其,中,gpt,为细菌来源的,谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因,，用于筛选重组子。该,载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔,b,-,珠蛋白.,猴多瘤病毒,DNA（SV40）,利用,SV40 DNA,载体表达外源基因的程序,SV40,载体,病毒晚期基因启动子,筛选标记,ori,缺陷的,SV40,辅助病毒,去除细菌序列,插入外源基因,重组分子,分离病毒,DNA,转化,筛选,增殖,感染,猴多瘤病毒,DNA（SV40）,基因表达好,外源基因能高效表达,SV40 DNA,载体的特点,基因重排高,病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象,宿主范围窄,只能转染猴细胞,装载量较小,人乳多瘤病毒,DNA（BKV）,人乳多瘤,病毒（,BKV,）,属于,乳多瘤,病毒科乳头瘤病毒属，其基因,组为双链,DNA,，,感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自,人乳多瘤病毒的生物学特性,主复制，每个宿主细胞最高可达,500,个拷贝,人乳多瘤病毒,DNA（BKV）,人乳多瘤病毒表达载体的构建,BKV - E.,coli,穿梭载体,BKV,ori,BKV,gene,DRE,MMTP,Ap,r,E.,coli,ori,SV40 P,Neo,r,删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的,基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成,穿梭载体，它不能整合，同时也不能,形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。,安装细胞色素,P450 dioxin,介导的增强,子,DRE,，,控制小鼠乳腺癌启动子,MMTP,，,由其带动外源基因的表达。,SV40,来源的启动子控制,Neo,r,标记基因，以,G418,筛选重组子。,以此载体在人细胞系中表达,b,1-,干扰素和单纯疱疹病毒,B,蛋白获得成功。,人牛痘病毒,DNA,人牛痘,病毒是一个大型,DNA,病毒，基因组长,185,kb,，,能在宿主细,胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建,人牛痘病毒的生物学特性,出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的,病毒启动子的控制下高效表达。然而由于,牛痘,病毒基因组较大，体外,DNA,重组很困难，因此通常采用体内重组的方式进行。,人牛痘病毒,DNA,目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒,其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌,T7RNA,聚合酶,编码基因。在,人牛痘病毒,DNA,表达载体的构建,外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大,量表达,T7RNA,聚合酶，然后再将含有外源基因和,T7,启动子的细菌型重,组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体,DNA,上，并在,T7RNA,聚合酶的作用下表达出重组蛋白。,人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。,人牛痘病毒,DNA,利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序,牛痘病毒,启动子,T7 RNA,聚合酶基因,T7,启动子,外源基因,细菌重组质粒,感染,转化,培养,收集,D,高等哺乳动物的基因转移,8,外源基因在哺乳动物细胞中的表达,哺乳动物细胞的物理转化法,哺乳动物细胞的病毒转染法,哺乳动物细胞的物理转化法,利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达,盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻,了负担。但,外源基因表达,盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随,机整合在染色体,DNA,上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。,哺乳动物细胞的物理转化法,将待转化的,DNA,溶解在磷酸缓冲液中，加入,CaCl,2,溶液混匀，此,时,DNA,被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；,此时细胞膜形成吞噬泡，,磷酸钙晶体局部溶解膜结构，,DNA,便进入受,体细胞；,磷酸钙共沉淀法,将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37,保温,4-16,小时,弃去,DNA,溶液，加入新鲜培养基，继续培养7天即可筛选转化株。,如果在外源,DNA,中掺入少量的受体细胞内源性,DNA,可以提高转化,效率。利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒,DNA，,可使正常细胞转化为,癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最早理解。,哺乳动物细胞的物理转化法,将待转化的,DNA,溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的,样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时,电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在,悬浮液中的淋巴细胞等。,电击转化法,DNA,片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。,哺乳动物细胞的物理转化法,将待转化的,DNA,溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面,活性剂的存在下形成包埋水相,DNA,的,脂质体,结构。,合，,DNA,随即进入胞质和核内。,利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和,HeLa,脂质体介导法,将这种,脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融,细胞。,哺乳动物细胞的物理转化法,通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌,鼠，从其输卵管内取出受精卵；,性原核内。,上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操,显微注射法,借助于显微镜将纯化的,DNA,溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄,作，所以不太适用于基因的克隆和表达。,哺乳动物细胞的物理转化法,血影细胞,是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环,境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞,同时，外源,DNA,也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可,恢复原来的通透性。因此，可先将外源,DNA,转入,血影细胞，然后再将,血影细胞介导法,核结构。在,溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的,血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源,DNA,转入受,体细胞。,哺乳动物细胞的病毒转染法,以病毒,DNA,为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒,共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导,入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围,有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。,E,利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白,8,外源基因在哺乳动物细胞中的表达,哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体,利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂,利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子,VIII,哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊,方式。,氨甲喋呤,（,MTX,）,是动物细胞中的关键代谢酶,二氢叶酸还原酶,数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，,dhfr,基因均得以扩,增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶,通过强化基因扩增高效表达外源基因,（,DHFR,）,的特异性抑制剂，细胞培养物经,氨甲喋呤,处理后，绝大多,的表达水平，从而抵消,氨甲喋呤,的抑制效应。更重要的是，扩增的区,哺乳动物细胞内的基因扩增现象,域远远大于,dhfr,基因本身，即与,dhfr,基因相邻的,DNA,区域同时被扩增。,哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,通过强化基因扩增高效表达外源基因,DHFR-MTX,高效表达系统,外源基因,dhfr,转染,dhfr,-,细胞系,单克隆,培养,转移,0.05,m,M,MTX,培养,单克隆,转移,培养,单克隆,转移,5,m,M,MTX,0.25,m,M,MTX,培养,单克隆,外源基因扩增至100拷贝,哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,通过强化基因扩增高效表达外源基因,GS-MSX,高效表达系统,谷氨酰胺合成酶,（,GS,）,能解除,甲硫氨酸亚砜,（,MSX,）,对动物细,胞的毒害作用。先将带有,GS,编码基因,的载体转入培养的哺乳动物细,中不必使用,GS,缺陷型的受体细胞，而且在正常的,MSX,浓度下就能筛,选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是,GS-MSX,系统比,DHFR-,胞中，由于只有多拷贝的,GS,编码基因才能抗,MSX,，,所以在转染过程,MTX,系统优越之处。,哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,通过强化基因转录高效表达外源基因,在载体上安装病毒或细胞来源的强启,Ap,r,M13,ori,ColE1,ori,CMVP,Polylinker,Gene,Intron,SV40 T,PolyA,signal,高效表达载体,mRNA,前体,AAAAAAAAA,mRNA,动子以及有效的翻译元件，也是使外源基,因高效表达的一种手段，如：,细胞巨化病毒,CMV,的启动子,动物珠蛋白基因的,内含子,SV40,的,终止子,和,polyA,化,信号序列,绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体,上携带内含子结构，因为,mRNA,前体的剪,切能促进成熟,mRNA,向胞质的运输，有利,于翻译。有的还含有各种信号肽序列。,哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,利用哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白,迄今为止，已有大约,300,种重组蛋白药物正在进行临床试验，但,在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：,b,干扰素,g,干扰素,凝血因子,VIII,凝血因子,IX,促红细胞生成素（,EPO,）,生长因子（,hGH,）,白介素,2,（,IL-2,）,乙型肝炎表面抗原,单克隆抗体,CD4,受体,组织型纤溶酶原激活剂（,tPA,）,利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体,大多数恶性淋巴,Neo,r,鼠金属硫蛋白启动子,b,肌动蛋白启动子,抗体轻链,cDNA,b,肌动蛋白终止子,pL,dhfr,SV40,启动子,b,肌动蛋白启动子,抗体重链,cDNA,b,肌动蛋白终止子,pH,瘤细胞表面上都,有一种特异性的,糖蛋白,campath,用人源化的小鼠,抗,campath,抗体,治疗非霍金淋巴,细胞瘤患者，效,果良好。重组抗,体采用,DHFR-M,TX,系统表达。,利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂,第一个由重组哺乳动物,dhfr,启动子,人,tPA cDNA,终止子,细胞规模化生产的医用蛋白,是治疗急性心肌梗塞的溶血,栓药物：,人组织型纤溶酶原,激活剂,（,tPA,）。,同样采用,DHFR-MTX,系统表达，受体,细胞选用,CHO,系统。目前，,用该工艺路线生产的重组人,tPA,已经商品化。,信号肽编码序列,此外，人,tPA,也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低。,利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子,VIII,凝血因子,VIII,编码基因的缺陷与血友病密切相关。多年来，血友病,病人都是使用从人血中分离纯化的凝血因子,VIII,生物制品进行治疗，然,而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制,品的血友病人惨遭感染，其中10%的病人最终死于爱滋病而非血友病。,早在上述情况发生之前，人凝血因子,VIII,的,cDNA,便已被克隆和鉴,定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程。与,tPA,相似，人凝血因子,VIII,也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳,动物细胞生产，但目前商品化了的重组人凝血因子,VIII,尚不能满足几代,血友病人的大量需求。,D,高等哺乳动物的基因转移,8,外源基因在哺乳动物细胞中的表达,C,高等哺乳动物的载体系统,B,高等哺乳动物的受体系统,A,高等哺乳动物基因工程的基本概念,E,利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白,重组,D,NA,技术与,基因工程,5,2,3,4,1,6,7,8,9,重组,DNA,技术与基因工程的基本概念,重组,DNA,技术与基因工程的基本原理,重组,DNA,技术所需的基本条件,重组,DNA,技术的操作过程,目的基因的克隆与基因文库的构建,外源基因在大肠杆菌中的表达,外源基因在酵母菌中的表达,外源基因在哺乳动物细胞中的表达,外源基因表达产物的分离纯化,A,重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则,9,外源基因表达产物的分离纯化,针对不同的产物表达形式采取不同的策略,针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型,多种分离纯化技术的联合运用,合适分离纯化介质的选择,分离纯化过程的规模化,针对不同的产物表达形式采取不同的策略,采用,分泌型战略,表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在,纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；,采用,包涵体型战略,表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；,采用,融合型战略,表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选,用亲和层析进行纯化,表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中,的蛋白质，应用低浓度的溶,菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。,针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型,等电点,处于极端区域（,pI,5,或,pI,8,）的重组蛋白应首选离子,交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；,重组蛋白特异性的,配体,、,底物,、,抗体,、,糖链,等都是首选亲合层析,纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合,适的范围内（,10,-8,- 10,-4,mol / L,）；,疏水层析,和,反相层析,是根据蛋白质的,疏水性差异,进行分离的；,凝胶过滤层析,是根据蛋白的,分子量和体积差异,进行分离的；,径向层析,是近年来发展起来的集,层析分离,和,膜分离,于一体的一种,复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。,多种分离纯化技术的联合运用,在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来,说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：,应选择不同分离纯化机理的方法联合使用,应首先选择能除去含量最多杂质的方法,应尽量选择高效的分离方法,应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段,合适分离纯化介质的选择,常用的蛋白质分离纯化介质有,Sephadex,和,Seperose,。,理想的分,离纯化介质应具有下列性质：,对目标蛋白具有较高的分离效率,对目标蛋白不会造成变性,化学性能和机械性能稳定，重复性好,价格低廉,分离纯化过程的规模化,蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程,未必合适，如：,实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）,实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）,因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。,B,离子交换层析,9,外源基因表达产物的分离纯化,离子交换层析的基本原理,离子交换介质的基本性质,离子交换层析的基本操作,离子交换介质的选择原则,离子交换层析的基本原理,离子交换层析是以,离子交换剂,为,固定相,，以特定的,含离子溶液,为,流动相,，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混,合物中不同离子进行分离的层析技术。,离子交换介质的基本性质,离子交换剂,亦称,离子交换介质，,通常是一种不溶性高分子化合物,如,树脂,，,纤维素,，,葡聚糖,，,醇脂糖,等；,离子交换剂,中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳,离子交换剂的基本性能,离子或阴离子起交换作用,如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗,脱时，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数,吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变,pH,使吸附的蛋白质失去,电荷而解离下来,不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大,小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个,洗脱下来，达到分离纯化的目的,离子交换介质的基本性质,阴离子交换剂：强碱型和弱碱型,可电离的基团磺酸基（,-,SO,3,H,）,离子交换剂的分类,磷酸基（,-,PO,3,H,2,）,羧酸基（,-,COOH,）,酚羟基（,-,OH,）,阳离子交换剂：强酸型和弱酸型,可电离的基团伯胺基（,-,NH,2,）,仲胺基（,-,NHCH,3,）,叔胺基（,-,N(CH,3,),2,）,季胺基（,-,N,+,(CH,3,),3,）,离子交换介质的基本性质,离子交换剂的分类,强离子交换剂,的电离率基本不受,pH,值影响，离子交换作用的,pH,范围宽,弱离子交换剂,的电离率受,pH,影响很大，离子交换作用的,pH,范围小,弱酸性阳离子交换剂在,pH,值降低时，其电离率逐渐降低，离子,交换能力逐渐减弱,弱碱性阴离子交换剂在,pH,值升高时，其电离率逐渐降低，离子,交换能力逐渐减弱,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换树脂：,最常见的,离子交换树脂,是含有酸性或碱性基团的人工合成的,聚苯,乙烯-二乙烯苯,不溶性高分子化合物,离子交换树脂的优点,是：,流速快，对小分子物质的交换容量大，,因而适合用于,氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换纤维素：,离子交换纤维素,是携带功能基团,纤维素衍生物，具有松散的亲水,性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大,分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大,阳离子型,离子交换纤维素包括,羟甲基纤维素,（,CM,纤维素）等,维素）,阴离子型,离子交换纤维素包括,二乙基氨基乙基纤维素,（,DEAE,纤,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换葡聚糖：,离子交换葡聚糖,是葡聚糖,经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三,维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（,Sephadex,G）,Sephadex,的优点如下：,亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核,酸,及其它生物分子的非特异性吸附能力小,电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快,既有离子交换作用，又有分子筛效应,因而,Sephadex,是一类广泛应用的色谱分离介质,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换葡聚糖：,常用的离子交换葡聚糖包括：,阳离子交换剂,CM-,Sephadex,C-25,，,CM-,Sephadex,C-50,Sephadex,C-25,，,Sephadex,C-50,阴离子交换剂,DEAE-,Sephadex,A-25,，,DEAE-,Sephadex,A-50,QAE-,Sephadex,A-25,，,QAE-,Sephadex,A-50,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换琼脂糖：,离子交换琼脂糖,是携带,DEAE,或,CM,基团的,Sepharose,CL-6B,DEAE-,Sepharose,（,阴离子型,）和,CM-,Sepharose,（,阳离子型）,尤其是介质受,pH,和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因,的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点,此具有稳定的外形体积,离子交换介质的选择原则,一般而言：,酸性,物质用,阴离子,交换剂分离,氨基酸、核苷酸、蛋白质等,两性电解质,，可根据其,pI,值,及,离子化,碱性,物质用,阳离子,交换剂分离,曲线,来选择,离子交换介质的选择原则,1,2,3,4,6,7,8,9,10,5,pH,+,-,蛋,白,质,净,电,荷,等电点,吸附阴离子交换剂,吸附阳离子交换剂,pH,pI,（,-,）,对,pI,=5,的某酸性蛋白质,在,pH,5.5-9.0,的范围内，,当蛋白质为阴离子时，,应首选,DEAE,纤维素,；,在,pH,3.5-4.5,的范围内，,当蛋白质为阳离子时，,应首选,CM,纤维素,离子交换层析的基本操作,层析柱平衡,平衡缓冲液的用量至少为柱体积的,2,倍,平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速,平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、,pH,值与缓冲液一致,为准，其中,pH,值最重要,离子交换层析的基本操作,样品进柱,为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质,交换容量,的,10-20%,为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高,交换容量,：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数,离子交换层析的基本操作,样品洗脱,恒定洗脱,阶段洗脱,梯度洗脱,10,20,30,40,50,60,70,80,90,分子浓度,离子强度,pH,值,C,凝胶层析,9,外源基因表达产物的分离纯化,凝胶层析的基本原理,凝胶介质的基本性质,凝胶层析的基本操作,凝胶介质的选用原则,凝胶层析的基本原理,凝胶层析是,利用有一定孔径范围的,多孔凝胶,作为固定相，对混合,物,中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为,分子筛,分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之,外，即,全排阻,；,两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们,下行速度快,分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙,即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢,鉴于上述原理，,凝胶层析可用于重组蛋白溶液,脱盐,、,分子量测定,以及,分离纯化,。,凝胶介质的基本性质,葡聚糖凝胶的种类有,G10,、,G15,、,G25,、,G50,、,G75,、,G100,、,G,150、,G200，G,50,即表示每克,干凝胶的吸水量为,5.0,毫升,葡聚糖凝胶,对碱比较稳定,，在酸性环境中其糖苷键易水解,湿态的葡聚糖可加热到,110,，干的则能耐受,120,高温,葡聚糖凝胶（,Sephadex,）,Sephadex,LH,是羟丙基化的,Sephadex,，,这类层析介质的流动相既,可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此,适用于非水溶性溶,质的凝胶过滤,凝胶介质的基本性质,琼脂糖凝胶,是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有,Sepharose,（,Sepharose,2B,、,4B,、,6B,，,数字代表干胶的百分比,）和,Bio-Gel-A,等,（,Bio-Gel-A,0.5M,、,1.5M,、,5M,、,15M,、,50M,、,150,M,，,数字,X10,6,代表排,阻限度。,琼脂糖凝胶,当温度高于,50,时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。,琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大,分子物质（如蛋白质和,DNA,）。,Sepharose,CL,是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔径大小和分离范围,与普通,琼脂糖,一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。,凝胶介质的基本性质,聚丙烯酰胺,凝胶,是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联,而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交,联剂越多，孔隙越小。,聚丙烯酰胺凝胶的商品名为,Bio-Gel，,型号从,P-2,至,P-300,共,10,种,聚丙烯酰胺,凝胶,（,数字,X1000,就相当于该凝胶的排阻限度）,凝胶介质的选用原则,将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为,组别分离,，其分,离策略是,使高分子物质完全,被排阻,，,小分子物质完全渗入凝胶内。,组别分离一般选用,Sephadex,G-25,或,G-50,，,对于小肽和低分子量,的物质（分子量范围,1000-5000,）的脱盐可选用,Sephadex,G-10,、,G-,组别分离,15,、,Bio-Gel P-2,或,P-,4,凝胶介质的选用原则,将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫,分级分离,该策略是,使高分子物质完全,被排阻,，,小分子物质完全渗入凝胶内。,分级分离一般选用,排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶,在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由,分级分离,于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。,凝胶层析的基本操作,平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速,注意凝胶的断层和气泡,层析柱平衡,操作压控制,平衡和洗脱时应维持流速恒定,恒定的操作压是恒流的先决条件,凝胶层析的基本操作,上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：,进样体积,进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的,10%,进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能,窄，这样洗脱出的峰形好,D,亲和层析,9,外源基因表达产物的分离纯化,亲和层析的基本概念,亲和层析载体的性质与选择,亲和层析配基的性质与选择,亲和层析的基本操作,亲和层析的基本概念,亲和层析,是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力,进行分离的一类,特殊的层析技术，它有如下特点：,纯化过程简单、迅速，且分离效率高,特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子,亲和层析的基本特点,纯化倍数大，产物纯度高,必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件,因此应用范围受到一定的限制,亲和层析的基本概念,抗原与抗体,DNA,与互补,DNA,或,RNA（,cDNA,、,mRNA,),酶与其底物、竞争性抑制剂、,辅酶因子,激素或药物与其受体,具有特异性亲和作用的生物分子,维生素于其特异性结合蛋白,糖蛋白与其相应的植物凝集素,亲和层析的基本概念,亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连,作为固定相吸附剂,当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有,和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结,亲和层析的基本原理,合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出,然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来,亲和层析载体的性质与选择,具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过,具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速,亲和层析载体的选择,具有惰性，尽量减少非专一性吸附,具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合,偶联,在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性,亲和层析载体的性质与选择,纤维素,葡聚糖凝胶,常用的亲和层析载体,琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,其它新型载体,亲和层析配基的性质与选择,纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力,但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的,亲和层析配基的选择,条件就要强烈，,这样可能使生物分子变性,配基必须具有适当的化学基团，,这种基团不参与配基与生物,分子之间特异结合，但可用于,和载体相连，同时又不影响配,基与生物分子之间的亲和力,亲和层析配基的性质与选择,酸酐法,N-,取代羟基琥珀酰亚胺法,配基的偶联,叠氮化作用,还原性烷基化合物（西夫碱）的形成,亲和层析的基本操作,通常采用改变,pH,、,离子强度、离子种类或者温度等使与固定配,泛的是改变溶液的离子强度。,非专一性洗脱,化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低,基结合的生物大分子的构象发生变化，降低其亲和力，但使用较广,非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发,生变化，,而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定,亲和层析的基本操作,使用,特异的配基作为洗脱剂,溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗,专一性洗脱,使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物,脱目标产物,亲和层析的基本操作,亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载,性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法,特殊性洗脱,体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。实际上特殊,E,膜分离,9,外源基因表达产物的分离纯化,膜分离的基本原理,分离膜的主要性能,影响膜分离的因素,膜分离的基本原理,膜分离是利用膜的选择性，以膜的两侧存在一定量的能量差作为,化，它是一种物质被透过或被截留的过程，近似于筛分过程，依据滤,膜分离的基本定义,推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移速率不同而实现的分离。,膜分离是,利用具有一定选择性透过特性的介质进行物质的分离纯,膜孔径和物质粒子的大小而达到物质分离的目的,膜分离的基本原理,分子级别的分离过程，分离效率高,膜分离的特点,不涉及相变，能耗低，运行成本低,膜分离为单纯物理变化，无二次污染,膜分离的基本原理,分离膜的选择通透性：是物质分离的,第一机制,膜分离过程的重要参数,膜分离过程的推动力：,静压力差,、,浓度差,、,电位差,物质通过分离膜的速度：是物质分离的,第二机制,膜分离的基本原理,根据分离膜,膜内平均孔径、推动力和传递机制不同，膜分离可,膜分离的主要类型,反渗透,（,Reverse osmosis RO,）,透析（,Dialysis DS,）,分成,下列几类：,超滤（,Uitrfiltration,UF,）,微滤（,Microfitration,MF,）,电渗析,（,Electrodialysis,EI,）,膜分离的基本原理,透析（,Dialysis DS,）,膜分离的主要类型,透析过程,使用,一种只透过溶剂而不透过溶质的膜，一般称为理,当把溶剂和溶液（或把两种不同浓度的溶液）分别置于此两侧,想的半透膜,时，纯溶剂将自然穿过半透膜而自发地向溶液（或从低浓度向高浓,度）一侧流动，这种现象叫,渗透,膜分离的基本原理,反渗透,（,Reverse osmosis RO,）,膜分离的主要类型,反渗透,其主要原理是在高于溶液渗透压的作用下，使其它物质,溶解盐类、胶体、微生物、热源、有机物等，因而主要用于海水、,不能透过半透膜，而将这些物质与水分离开来，有效地去除水中的,苦咸水淡化和产纯水制备等方面,膜分离的基本原理,超滤（,Uitrfiltration,UF,）,膜分离的主要类型,超滤,是一种,根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相,相应的截留分子量范围从500到100万左右。,对分子质量的差别进行分离的方法。筛分孔径范围,1,nm - 0.1,m,m,，,分离膜的基本性能,分离膜是膜分离技术的核心，分离膜的性能主要包括,分离透过,性、耐酸碱性、抗氧化性、抗微生物降解性、亲水性、疏水性、电,性能和,化学物理,性能两部分。其中，化学物理性能主要涉及到耐热,性能、毒性、机械强度等。,膜的化学物理性能,分离膜的基本性能,微滤膜,0.025 - 14,m,m,反渗透膜,0.0001 - 0.001,m,m,超滤膜,0.001 - 0.02,m,m,纳米过滤膜平均孔径,2,nm,膜的分类,按膜的孔径大小分类：,分离膜的基本性能,对称性膜,膜截面上的孔道结构均匀,不对称性膜,由表面活性层（超薄层）和惰性层（支撑层）构成,膜的分类,按膜的结构分类：,传质阻力大，透过通量低，易污染、难清洗,传质阻力小，透过通量高，被广泛使用,分离膜的基本性能,天然高分子膜,醋酸纤维素、硝酸纤维素、再生纤维素,合成聚合物膜,聚砜、聚酰胺、聚烯、含氟聚合物,膜的分类,按膜的材料分类：,无机材料膜,陶瓷、微孔玻璃、不锈钢、碳素,将膜固定在合适的支撑物上即构成膜组件，商品化的膜组件有：,管式,、,板式,、,螺旋圈式,、,中空纤维,（毛细管）,影响膜分离的因素,影响膜分离效率的主要因素是膜的污染，其表现形式是：,溶质在膜孔内吸附,造成膜污染的主要原因是：,蛋白质在不同,pH,条件下所带电荷对膜电荷的相互作用,无机盐通过形成复合物、改变溶液离子强度等机制污染膜,溶质在膜表面沉淀或结晶,膜分离过程中体系的粘度增大会污染膜,F,原核生物表达的重组蛋白质量检测,9,外源基因表达产物的分离纯化,工业化生产的重组蛋白必须经过严格的质量控制才能成为产品。,重组蛋白的质量控制指标包括：,重组蛋白的鉴别（序列）,重组蛋白的纯度（杂质的类型）,重组蛋白的活性（检测方法）,重组蛋白的安全性,重组蛋白的稳定性,重组蛋白的一致性（构象与构型）,原核细菌表达的重组蛋白产物的质量检测项目与方法,检测项目,检测方法,产品是否含内毒素,家兔热原法,蛋白质是否变异,肽谱、,HPLC、,等电聚焦、毛细管电泳,甲硫氨酸是否被甲酰化,肽谱、质谱、,HPLC、,Edman,分析,蛋白质是否变性、聚合、脱氨基,SDS-PAGE、,凝胶层析、等电聚焦、质,配体是否脱落,SDS-PAGE、,免疫分析,氨基酸是否发生取代,氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳,产品是否被细菌、病毒、支原体等污染,微生物学检测,谱、,HPLC、,毛细管电泳、,Edman,分析,D,亲和层析,9,外源基因表达产物的分离纯化,C,凝胶层析,B,离子交换层析,A,重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则,F,原核生物表达的重组蛋白质量检测,E,膜分离,重组,D,NA,技术与,基因工程,5,2,3,4,1,6,7,8,9,重组,DNA,技术与基因工程的基本概念,重组,DNA,技术与基因工程的基本原理,重组,DNA,技术所需的基本条件,重组,DNA,技术的操作过程,目的基因的克隆与基因文库的构建,外源基因在大肠杆菌中的表达,外源基因在酵母菌中的表达,外源基因在哺乳动物细胞中的表达,外源基因表达产物的分离纯化,