PET系统_原核表达详细总结

,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,PET,原核表达系统,pET,系统是有史以来在,E.coli,中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到,pET,质粒载体上。受噬菌体,T7,强转录及翻译信号控制，表达由宿主细胞提供的,T7RNA,聚合酶诱导。,T7RNA,聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。,不依赖连接反应的克隆方法（,LIC,）,用,LIC,法制备的,pET,载体有不互补的单链粘端，与目的插入片段上相应的粘端互补。扩增目的插入片段的引物,5,端序列要与,LIC,载体互补。,T4DNA,聚合酶的,3,-5,外切酶活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由制备好的插入片段和载体互相形成退化产物，这种方法十分快速高效且为定向克隆。,pET,载体上编码的氨基酸序列可通过肠激酶或,X,因子去掉。,Function of T7 Polymerase,The 35 exonuclease activity of T4 DNA,polymerase removes nucleotides until it encounters a residue corresponding to the single dNTPpresent in the reaction mix. At this point the 53 polymerase activity of the enzyme counteractsthe exonuclease activity to effectively prevent further excision.,pET,载体,pET,载体最初是由,Studier,及其同事构建。,(Studier and Moffatt,1986; Rosenberg et al., 1987; Studier et al., 1990).,包括两种载体,转录载体（用于表达本身含有核糖体结合位点和起始密码子目的基因）和翻译载体（载体上带有核糖体结合位点）。一般来说，转录载体用于表达来自原核的基因，而翻译载体表达真核基因。,抗生素抗性,pET,载体常用的两种筛选标记是,Ampr+,和,Knar+,因为内酰胺酶的消化和,PH,的降低，,Ampr+,的选择性易于丢失。某种情况下使用,Knar+,更为有利。,Ampr+,和,Knar+,的另一个不同是两种基因的转录方向不同 。,Ampr+,位于,T7,启动子下游，与其方向相同。除了,pET5,系列，,T7,转录终止序列位于内酰胺酶基因前面，但是这个终止序列只有,70%,的有效性。因此，,T7,聚合酶能够通读，导致内酰胺酶的积累。相反,Knar+,的转录方向与,T7,启动子方向相反，诱导时并没有,Knar+,基因的增加。,用于克隆的宿主菌,用于克隆的宿主菌通常是,Novablue,，,JM109,以及,DH5a,。这些菌株是,rec,-,end,-,型，转化效率高，且质粒产量也高，适合用于保存带有克隆目的基因的,PET,载体。,用于表达的宿主菌,BL21(DE3),基因型：,F,ompT hsdSB,(,rB mB,),gal dcm,(DE3),无抗性,重组质粒转化到带有,T7RNA,聚合酶基因 的大肠杆菌中，即可开始产生蛋白了。这些菌株都是,DE3,溶原菌。噬菌体,DE3,是一种衍生噬菌体，带有噬菌体,21,抗性区和,lacI,基因，,lacUV5,启动子，以及,T7RNA,聚合酶基因,。这一区段被插入,int,基因，因此阻止了,DE3,在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出，一旦形成,DE3,溶原状态，就只有受,IPTG,诱导的,lacUV5,启动子指导,T7RNA,聚合酶基因转录。,BL21(DE3),BL21(DE3),是应用最广泛的表达宿主菌。是,lon,蛋白酶和,ompT,膜外蛋白酶（纯化过程可以降解蛋白）缺陷型。目的蛋白,BL21,中更加稳定。,因为,BL21(DE3),对利福平敏感，如果有必要可以用利福平来限制宿主,RNA,和蛋白质的背景合成。,应该注意一些带有,T7,启动子的商业载体原则上可以用来表达，然而，只有,T7,启动子而没有额外的,lac,阻遏子基因的载体并不适合。这些载体上的多拷贝,lac,操纵 子（用于蓝白斑筛选）会结合,lac,抑制因子，使,pet,菌株中同样受,lac,抑制因子控制的基因部分表达。结果基本的,T7RNA,聚合酶活性升高，使目的基因的稳定性受到影响。,lacUV5 Promoter,与野生型,lac,启动子相比，控制,T7RNA,聚合酶表达的,lacUV5,启动子对,cAMP/CRP,的刺激并不敏感。然而，最近研究发现,rDE3,宿主菌在缺少葡萄糖的培养基生长到稳定期时，,cAMP,同样对,lacUV5,产生了去阻遏作用。尽管宿主菌长到稳定期并不推荐，菌体培养过夜（,16h,）后转入含有,1%,的葡萄糖的培养基中，可以有效避免去阻遏作用，因为,glucose,可以,cAMP,的产生。,T7lac Promoter,T7,启动子下游有个,Lac,启动子，它包含常规的启动子和,lacI,基因，,T7lac,与,lacI,启动子位置交错。采用这种载体及,DE3,溶原菌，,lac,阻遏蛋白可以作用与,T7RNA,聚合酶，也作用与载体,T7lac,启动子。阻断任何,T7RNA,聚合酶导致的目的基因转录。,pLysS,和,pLysE,宿主菌,另一个为目的基因提供稳定性保证的方法是在拥有兼容的氯霉素抗性编码表达少量,T7,溶菌酶（,T7RNA,聚合酶天然抑制物）的宿主中表达。,T7RNA,溶菌酶是一种双功能蛋白，它能够切割大肠杆菌细胞壁肽聚糖层，也可与聚合酶结合，阻止转录。,pLysS (or pLysE,）有助于目的蛋白的抽提,The presence of pLysS (or pLysE) has the further advantage of facilitating the preparation of cell extracts. After the target protein has accumulated, the cells are collected and suspended in a buffer such as 50 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, pH 8.0. Simply freezing and thawing, or adding 0.1% Triton X-100, will allow the resident T7 lysozyme to efficiently lyse the cells. This property can make it advantageous to carry pLysS in the cell even when it is not required for stabilizing the target plasmid.,载体与宿主共同影响表达水平,实际操作中，通常要尝试多种不同的载体,/,宿主菌组合以期获得拥有正确结构的目的蛋白的高水平表达。,The pET System Process,Prepare pET Vector,Prepare Insert DNA,Clone Insert into pET Vector,Transform into Expression Host,Induce and Optimize Expression of Target Protein,Scale-up,Purify Target Protein,PCR,法制备插入片段有引入突变的风险，可以采用以下方法降低,PCR,反应的突变：,采用高保真的酶,减少循环数,增加模板浓度,增加引物浓度,片段与载体连接,For a standard reaction using DNA fragmentswith 24 base sticky ends, use 50-100 ng(0.0150.03 pmol) of pET vector with 0.2 pmol insert (50 ng of a 500 bp fragment) in avolume of 20l.Assemble the following components in a 1.5 ml tube (these components are available separately in the DNA Ligation Kit, Cat. No. 69838-3). Add the ligase last.,接菌于,LB,液体培养基，摇过夜,.,取,1.5ml,于,EP,管，,12,000 g,离心,1min.,彻底去除上清,.,用,100ul solutionI,悬浮菌体,.,加,200ul,新鲜配制的,0.2 N NaOH, 1% SDS,，颠倒混匀，冰上放置,3min.,加,150ul150 l of ice-cold 3 M NaOAc, pH 5.2,。颠倒混匀，冰上放置,5min,。,12000rpm,，离心,5min,。转移上清到一个新的,Ep,管。,加,400 l TE-buffered phenol:chloroform:isoamyl alcoho(25:24:1),，涡旋震荡,30s,。,12,000 g for 5 min at 4,C.,倒掉上清，加,400ul,乙醇。,重悬沉淀，,30ul,含,20ug/mlRNAse,的,TEbuffer,。,37,放置,15min,。,质粒小量制备,solutionI,（,ice-cold 50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mMEDTA,预冷）,表达宿主菌的诱导,For pET constructions carrying the “plain” T7 promoter, a final concentration of 0.4 mM IPTG is recommended, while,1 mM,IPTG is recommended with vectors having the T7,lac,promoter. An,准备诱导表达,Pick a single colony from a freshly streaked plate and inoculate 50 ml LB containing the appropriate antibiotic in a 250 ml Erlenmeyer flask. (For good aeration, add medium up to only 20% of the total flask volume.),另一种诱导方法,Alternatively, inoculate a single colony or a few microliters from a glycerol stock,into 2 ml LB,medium containing the appropriate antibiotic.,Incubate with shaking at 37C until the OD600,reaches 0.61.0,.,Store the culture at 4C overnight,. The following morning,collect the cells by centrifugation (30 sec in a microcentrifuge,). Resuspend the cells in,2 ml fresh medium plus antibiotic and use this to inoculate 50 ml medium.,诱导的步骤,37,摇床培养到,OD,600,0.4-0.1,（建议,OD,600,为,0.6,）约,3,个小时可达到,.,从中取出一些样品作为未诱导对照及滴度测试。在剩下的样品中加入,100mMIPTG,储液至终浓度,0.4,（,T7,启动子）或,1mM,（,T7lac,启动子），继续培养,2-3,小时。,将摇瓶冰上放置,5min,，,5000g4,离心。如果需要收集上清进行进一步分析。,重悬细胞于,0.25,倍体积预冷的,20mMTris-Hcl,（,PH8.0,）中离心。,出去上清，菌体保存于,-70,冰箱或继续纯化。,优化表达条件,质粒稳定性测试,平板,1,：,10,-6,稀释在琼脂板 。结果，所有细胞都生长。,平板,2,：,10,-6,稀释在含抗生素平板。结果只有携带质粒细胞生长。,平板,3,：,10,-5,稀释在含,IPTG,平板。结果，只有质粒已丢失或无法表达的目的基因的细胞能生长。,平板,4,：,10,-5,稀释在含,1mMIPTG,和抗生素平板。结果，只有仍携带质粒但已失去表达目的基因能力的细胞能生长。,IPTG,将阻止任何带有,T7RNA,聚合酶诱导基因和功能目的质粒的细胞形成菌落,。,III,，,IV,不适用于,pLysS,，,pLysE,质粒和,T7lac,启动子。,优化表达条件,The optimal scheme and time course for induction can vary, because the characteristics of each target gene product are unique.,Example,：,37,生长常常会导致一些蛋白质积累形成包涵体，而,30,生长则可能产生有活性的蛋白。如果想利用一些,pET,载体中的信号肽序列输出蛋白的话，在,25,或,30,生长和培养可能是最优化的。在某些情况下，低温（,15-20,）延长诱导时间（过夜）可以使溶解性蛋白产量达到最大。,优化表达条件,裂解缓冲液,裂解缓冲液的性质会大大影响到目的蛋白可溶与不溶之间的比例。当采用一般的裂解缓冲液如,1His Bind Binding,（包括,500mM,）缓冲液时，一些包含疏水或膜相关结构域的蛋白可能被归于不容部分，但并不出现在包涵体中。在裂解缓冲液中加入毫摩尔的非离子型或双性去污剂可以将由于细菌脂或膜结合而不容的蛋白组分转变为可溶组分。,BugBuster,蛋白抽提试剂或,PopCulture,与,rLysozyme,一起使用，是使蛋白溶解的理想选择。非离子型和双性去污剂能够溶解细胞壁和膜组分，因此，无需变性就可以释放出胞内蛋白。,优化表达条件,包涵体的形成有利于纯化，因为：,通过离心可以很容易的获得高产量而且比较纯的蛋白。,包涵体的形成可以避免蛋白受到蛋白酶的降解。,有毒蛋白以包涵体形式存在，可以避免其对细胞生长的抑制,。,近些年来，包涵体的解折叠的方法学上取得了很大的进步。报道了很多解折叠方案，不同的目的蛋白的解折叠方案不同，主要是根据经验来决定。蛋白质解折叠试剂盒提供了一套试剂，能很方便的促进一些蛋白的重折叠,。,优化表达条件,二硫键的形成,pET-32, pET-39 and pET-40,溶解性可以通过选择载体，克隆位点或是宿主菌来调控。例如，,pET-32,系列载体产生硫氧还蛋白的融合蛋白，可以增加胞质中可溶蛋白的产量。,AD494,或,BL21,trxB,菌株可以在胞质中形成二硫键。,If your target protein contains one or more essential disulfide bonds, the combination of a,pET-32 vector,and,a,trxB,host,may prove to be optimal because disulfide bond formation in the cytoplasm appears to bedependent on the presence of thioredoxins (Stewart et al., 1998).,优化表达条件,蛋白质在细胞周质中易于形成二硫键，利于蛋白质的折叠。,与胞质中不同，大肠杆菌细胞周质是一个氧化的环境，含有催化二硫键形成的酶。要想得到正确折叠，有活性的含二硫键的目的蛋白，一个常用的策略就是，将异源蛋白运输到细胞周质中。一般来说，通过目的基因与,号肽基因融合，可以使表达蛋白定位于周质。,注意：过表达的,DsbC,酶是以氧化形式存在的，必须暴露在还原试剂中（,0.1-1.0mMDTT,）在体外才表现出二硫键异构酶的活性。,Typically, a DsbC fusion protein expressed from pET-40b(+) is first purified by HisBind chromatography. Prior to exposing the fusion protein to a reducing agent, either EDTA should be added to a final concentration of 1 mM, or the sample should be dialyzed to remove residual Ni2+.,影响目标蛋白稳定性的,N,端原则,Another factor that appears to influence target protein stability is the amino acid immediately following the N-terminal methionine (penultimate amino acid). The amino acid at this position determines the removal of N-terminal fMet. Processing is catalyzed by methionyl aminopeptidase and is governed by the following relationship: the degree of removal decreases as the size of the penultimate amino acid side chain increases (Hirel et al., 1989; Lathop et al., 1992). In practice, little or no processing was observed by these authors when the following amino acids occupied the penultimate position: His,Gln, Glu, Phe, Met, Lys, Tyr, Trp, Arg,. Processing ranged from 16%97% when the remaining amino acids occupied this position. Tobias et al. (1991) have determined the relationship between a proteins amino terminal amino acid and its stability in bacteria, i.e., the N-end rule. They reported protein half-lives of only 2 minutes when the following amino acids were present at the amino terminus:,Arg, Lys, Phe, Leu, Trp, and Tyr,. In contrast, all other amino acids conferred half-lives of 10 hours when present at the amino terminus in the protein examined.,Leu in the penultimate position would be a poor choice,！,有时除了全长目的蛋白还会发现未完全表达的截短蛋白，一个显见的解释就是蛋白降解，而次翻译起始位点是另一种可能。若一个类似核糖体结合位点（,AAGGAAG,）的序列加上适当的间隔序列（一般是,5-13,个核苷酸），位于,AUG,密码子上游，会发生上述情况。一个可能的解决方法是采用,pET,载体，可以在两端都有融合标签。,其他影响表达水平的因素,mRNA,转录产物的二级结构。,意外的终止密码子。,转录终止子。,不稳定目的,mRNA,及蛋白。,