东北农业大学大豆研究所生物技术应用研究进展情况-Power

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(44.72%)SSR引物-偏分离,原因:一些引物在143个RILs群体中缺失较多,一些RILs位点杂合个数较多,15个sat_091、satt009、satt012、satt584、satt521,重组自交系材料构建过程可能导致偏分离的产生,5,RIL群体遗传结构分析,群体的遗传结构-各株系亲本的基因型组成,父母本对群体总体及各株系的遗传贡献率,东农594-平均遗传贡献率为46%,对各株系分布在14-80%,Charleston-平均遗传贡献率为53%,对各株系分布在20-86%,RILs群体株系评价,各株系的多样性指数(SHANNON)均值为4.93,分布在4.56-5.06,比较接近完全平衡时的5.04,平均遗传相似系数为0.892,0.682-0.997,部分集中在0.95-0.98,研究结果RIL群体株系的评价,6,大豆遗传图谱NEAUSRI GMS,1913.5cM,20连锁群,161 SSR,标记间平均距离为11.89cM,每个连锁群长度变动在0.4cM-309.5cM之间,连锁群上的标记数在2-28个之间,研究结果遗传图谱构建,7,8,GM19-N,GM20-O,9,10,NEAUSRI遗传图谱,97/161 SSR引物与国内外对应连锁群上的相同引物对应,对应引物从GM2-A2、GM13-H、GM18-M的1个到GM7-D1a 12个,平均配对个数为4.85个,对应个数少的连锁群主要是本研究中SSR引物较少的几个连锁群,与国内外图谱比较,11,二、大豆功能基因分离与鉴定,大豆抗病相关基因的分离与鉴定,大豆其它基因的分离,12,疫霉根腐病菌培养,种植绥农10,接种样品,Total RNA提取,RGA扩增与克隆,RGA产物测序与鉴定,全长基因获得RACE方法,大豆SR1基因的斑点杂交和Southern杂交,大豆SR1的转录表达检测,取 样,2.1.1 研究方法,2.1 大豆抗病相关基因的分离与鉴定,13,2.1.2,研究结果,抗病基因同源序列的获得,提取绥农10号叶片总RNA,泳道,14,分别为接种后,24,、,36,、,48,、,60h,取样提取的绥农,10,号叶片总,RNA,RT-PCR扩增大豆抗病基因同源序列,500bp,M:DL2000 marker,1:RT-PCR扩增片断,2:CK,RT-PCR,Degenerate oligonucleotide primers designed according to,N,and,RPS2,and,L6,P1-P3,cDNA from Suinong 10,1 2 3 4,M 1 2,28S,18S,RT-PCR扩增结果,14,目的cDNA片段的克隆及鉴定,克隆的鉴定-蓝白斑筛选,1,:转化后的大肠杆菌,DH5,在,100mg/ml Amp,的,LB,培养基的生长;,2,:未转化的,DH5,在100,m,g/,m,l,Amp,的,LB,培养基的生长;,3,:未转化的,DH5,在无,Amp,的,LB,培养基的生长,1,2,3,15,克隆的鉴定-质粒酶切,M1 1 2 3 4 5 6 7 M2,M1:-EcoT14I marker;17:转化后质粒,EcoR,I酶切;M2:DL2000 marker,质粒酶切鉴定,PCR,产物的插入,送交5个测序,有两个通读,3.0kb,500bp,16,SR1,全长cDNA的获得,5,RACE的扩增结果以RNEAU-1为耙序列,M,:,DL2000 marker,,,1,:巢式,PCR,扩增产物,,2,:第一次,PCR,产物,900bp,M 1 2,17,3,RACE,扩增结果,M,:,-EcoT14I marker,,,1,:巢式,PCR,产物,,2,:第一次,PCR,产物,M 1 2,2.5kb,18,5,RACE和3,RACE与靶序列,RNEAU-1,的拼接,将5,RACE序列、3,RACE序列与靶序列,RNEAU-1,进行了拼接,得到3574bp的拼接序列。,19,全长cDNA序列的获得,M 1,3.5kb,M,:,-EcoT14I marker,,,1,:,RT-PCR扩,增产物,20,全基因测序,3574bp全长cDNA序列,3411bp的开放读码框,72bp的5,非翻译区,68bp的3,非翻译区,20bp的多聚腺苷酸尾,73bp ATG起始密码子,3484bp TAA终止密码子,编码1137个通读的蛋白质氨基酸序列,该基因被命名为,SR1,GenBank 注册号:AY193892,21,1,MAATTRSLAS,I,YDVFLSFTG,QDTRHGFTGY,LYKALDDRGI,YTFIDDQELP,RGDEIKPALS,61,DAIQGSRIAI,TVLSQNYAFS,TFCLDELVTI,LHCKSEGLLV,IPVFYKVDPS,HVRHQKGSYG,121,EAMAKHQKRF,KANKEKLQKW,RMALQQVADL,SG,YHFKDGDA YEYKFIQSIV EQVSREINRA,181,PLHVADYPVG LGSQVIEVRK LLDVGSDDVV HIIGIH,GMGG,LGKTTL,AVAV YNLIAPHFDE,241,SCFLQNVREE SNLKHLQSSL LSKLLGEKDI TLTSWQEGAS MIQHRLRRKK VL,LILDDVDK,301,REQLKAIVGK PD,WFGPGSRV,IIT,TRDKHLL KYHEVERTYE VKVLNHNAAL HLLTWNAFKR,361,EKIDPIYDDV LNRVVTYA,SG,LPLAL,EVIGS NLYGKTVAEW ESALETYKRI PSNEILKILQ,421,VSFDALEEEQ QNVFLDIACC FKGHEWTEVD DIFRALYGNG KKYHIGVLVE KSLIKYNRNN,481,RGTVQMHNLI QDMGREIERQ RSPEEPGKRK RLWSPKDIIQ VLKHNTGTSK IEIICLDSSI,541,SDKEETVEWN ENAFMKMENL KILIIRNGKF SIGPNYIPEG LRVLEWHRYP SNCLPSNFDP,601,INLVICKLPD SSITSFEFHG SSKK,LGHLTV,LNFDKCKFL,T QIPDVSD,LPN,LKELSFRKCE,661,SL,VAVDDSVG F,LNKLKKLSA,YGCRKL,TSFP PLN,LTSLRRL,QISGCSSL,EY FPEILGEMVK,721,IRVLELHDLP IKELPFSFQN LIGLSRLYLR RCRIVQLRCS LAMMSKLSVF RIENCNKWHW,781,VESEEGEETV GALWWRPEFS AKNCNLCDDF FLTGFKRFAH VGYLNLSGNN FTILPEFFKE,841,LKFLRTLDVS,DCEHL,QKIRG LPPNLKDFRA INCASLTSSS KSMLLNQELY EAGGTKFMFP,901,GTRIPEWFNQ QSSGHSSSFW FRNKFPAKLL CLLIAPVSVP LY,SLFP,PKVS FGHHVPYPKV,961,FINGKCQAFW GCHWKQRMME LDHTYIFDLQ KLPFENDNLF EEGAWEEEWN HVEVRYESVL,1021,ELESSLIKGS GIHIFREEGS MEEDIRFDDP YLSSSASESR TEEDIRFDDP YLSSSASESS,1081,TEEDIGFDDP YLSSSASESP SFLQTIALGT RKFSIAFFLF FSCFLFYYFG FSCKKFT,大豆,SR1,基因编码蛋白质产物的结构分析,1137 aa,TIR:红色划线区,NBS:蓝色划线区,LRR:黑色划线区,HD:疏水结构域,也称功能未知保守结构域1(绿色划线区),Conserved Domain 2: 功能未知保守结构域2(粉色划线区),22,SR1,基因的斑点杂交和Southern blot分析,1,:对照,,SR1,基因自身的杂交;,2,:,SR1,基因与绥农,10,号基因组的杂交,1,2,1,:,-DNA/,Hind,III+,EcoR,I marker,;,2,:阳性对照;,3-8,:绥农,10,基因组,DNA,用,Hind,III,、,Bam,HI,、,EcoR,I,、,EcoR,V,、,Dra,I,和,Taq,I,酶切后与探针的杂交,1 2 3 4 5 6 7 8,23,大豆,SR1,的转录表达研究,M,:,-EcoT14I marker,,,L,、,R,、,S,:分别代表,SR1,在大豆叶片、根和茎中的,RT-PCR,扩增,大豆,SR1,的器官特异性检测,接种大豆疫霉根腐病菌对,SR1,表达的影响,M L R S,M,:,-EcoT14I marker,,,1,:未接种时取样的,RT-PCR,,,2-7,:接种后,12,、,24,、,36,、,48,、,60,、,72h,取样的,RT-PCR,3.5kb,M 1 2 3 4 5 6 7,24,水杨酸对,SR1,表达的影响,3.5kb,M,:,-EcoT14I marker,,,1,:未喷洒水杨酸时取样的,RT-PCR,,,27,:喷洒水杨酸后,12,、,24,、,36,、,38,、,60,、,72h,取样的,RT-PCR,M 1 2 3 4 5 6 7,大豆,SR1,的转录表达研究,25,绥农10号基因组的克隆,M:-EcoT14I marker,1:基因组中的扩增片段,以S1-A1为引物在绥农10基因组中的扩增,基因组中的扩增,M:-EcoT14I marker,15:重组质粒,Not,I酶切,转化后重组质粒的酶切,扩增产物的克隆,26,与,SR1,cDNA,序列的比对,测序,测序获得,3972bp,的,DNA,序列,SR2,,,序列比对显示,SR2,基因含,有4,个内含子,27,2.2 大豆其它基因的分离,大豆抗逆相关基因延伸因子1,A的分离,研究方法,抗SMV品系东农8143,SSH技术,获得片段,RACE技术,得到全长,RT-PCR,基因表达与鉴定,SOUTHERN & NORTHERN,28,抗逆相关基因延伸因子1,A,1 ttgagacctg gtgtcttgaa gcctggaatg gtggtgactt ttgcaccaac tggactgaca 61 accgaagtta agtctgtgga aatgcaccat gaagctctca cagaggctct tcccggtgat 121 aatgttggat tcaatgttaa gaatgttgct gttaaggatc tcaagcgtgg ttatgttgcc 181 tcgaactcaa aggatgatcc tgccaaggag gctgctaact tcactgccca ggttatcatc 241 atgaaccatc ctggtcagat tggaaatggc tatgcccctg ttcttgactg ccacacttcc 301 cacattgctg tcaagtttgc tgaactcatg accaagattg acaggcgatc tggcaaagag 361 cttgagaagg aacccaagtt tttgaagaat ggtgatgctg gttttgttaa gatgattccg 421 accaaaccca tggtggttga aactttctct gagtaccccc cacttggtcg ctttgctgtc 481 agggatatgc gtcaaactgt tgctgtggga gtcatcaaga acgtggagaa gaaggatcct 541 actggagcca aggtcaccaa ggctgcccag aagaagaagt gaatcgtgcg gtttggttca 601 tcaggggatg tcgtttctta tggttacaat aaatgttggt ttcttgccct tgtgtcttcg 661 tttctaggta gcttgttttt cggacatagt ttgaagtctc caccatcatc tcgcaacttt 721 tgttcccaga attgggttct tgatcgacgg tggcaagact ccttttatca ttctgtttta 781 atgtgttgtg tttgtgagaa cccctgatta catttttgtt aagcgcagcg agttttaggg 841 ctttgccgtt gcgttgttgg tttgcttctt aaatgtcaac tttatatttg tgttcaattt 901 ttgcttggtt tgcttttaaa aaatcaaatt tatgtgtcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 961 aaaaa,GenBank,注册号:,AY651886,29,12,24,36,48,60,72,84,108,132,156,180,204,228,252,EF-1,A,40S,0,抗逆相关基因延伸因子1,ARTPCR分析,30,三、抗病基因分子标记,31,3.1,大豆灰斑病,7,号生理小种抗病基因分子标记,东农91212(,),东农9674(,),F2-3,感灰斑病7号生理小种,抗灰斑病7号生理小种,RAPD,OPS03,科学通报,1998,12:2302-2307,大豆对灰斑病菌7号小种抗性的遗传分析及抗病基因的RAPD标记,8.7cM,科学通报,1999,23:2544-2550,大豆灰斑病抗病基因RAPD标记的分子特征及抗、感种质的SCAR标记鉴定,32,3.2 大豆灰斑病7号生理小种抗病,基因分子标记,33,3.2.1,研究方法,东农40566(,),东农410(,),F2,F5,抗灰斑病8个生理小种,感灰斑病1号生理小种,结合,2002,年田间抗性接种鉴定结果和,2003,年盆栽抗性接种鉴定结果,-186,个株系,材料,34,实验方法,大豆灰斑病菌的培养,保存培养-FLS 1号小种 、 PDA培养基、4,/,20天,转接培养,-平板PDA培养基、25,/30天,扩大培养,-高粱培养基、25,/30天,接种培养-毛巾保湿培养、 25,/7天,群体抗性鉴定,群体种植、群体接种、病情调查,分子标记分析方法,DNA 提取、抗感池的建立、SSR分析,引物筛选分析,PCR反应 、Mapmaker/EXP3.0 、MapChart 2.1,35,3.2.2 研究结果群体抗性鉴定结果分析,卡方检验(2=0.9245) 差异不显著,感病:抗病符合1:1,36,引物筛选,1:抗亲;2:感亲;3-12建抗池单株;13-22建感池单株,SOYGPATR在小群体上的多态性表现,BSA法寻找SSR引物/500个,10个感病株系的带型与感亲带型完全一致,而抗病株系中有9个与抗亲带型一致,仅有一个株系的带型与抗性鉴定结果不符。,37,连锁分析,Satt565,38,抗病基因连锁图谱,连锁顺序:,Satt565SOYGPATR,Hrcs1,Satt396,连锁距离:,6.2cM6.5cM,Hrcs1,14.7cM,39,连锁群分析,抗FLS 1号生理小种基因,-SOYGPATR、 Satt565、Satt396位于,C1连锁群,与,Mian研究的美国Rcs 3 J 不同,抗病基因成簇分布 F、G和J,QTL分析抗病存在于各个连锁群-,大豆只有D1b、J、K、N,上无抗SCN基因位点,C1连锁群上有抗SCN RACE 2 和14的位点,40,四、大豆主要农艺性状的QTL分析,41,研究方法性状调查,品质性状,蛋白质含量,:株系混合脱粒后,取50克样品利用Perten8620测得,用百分数表示(),油分含量:,株系混合脱粒后,取50克样品利用Perten8620测得,用百分数表示(),蛋脂总量:,一个株系的蛋白质含量和油分含量的总和,用百分数表示(),产量性状,单株荚数:,单株全部正常结实的荚数,每一株系考种3株,计算均值,单株粒重:,单株全部正常结实的粒数,每一株系考种3株,计算均值,百粒重:,从单株正常结实粒中选取大小均匀的100粒称重,重复2次,计算均值(g),形态性状,株高,:在田间调查时,指从地面到主茎顶端生长点的长度,室内考种指从子叶节算起至主茎顶端的实际长度(cm),生育期:,自大豆播种出苗至正常成熟时的天数(D),分枝数,:主茎上有效分枝数(有两个节以上并有一节着荚的分枝),分枝上分枝计算在内,主茎节数,:从子叶节算起,至主茎顶端的实际节数,结荚习性,:指植株开花结荚状况,分无限(I)、亚有限(S)、有限(D)三类,花色,:指花瓣的颜色,分紫色(P)、白色(W)两类,茸毛色,:于成熟时调查,分灰色(P)、棕色(B)两类,叶形,:开花盛期植株中上部第8-10节复叶中间小叶的形状。分长叶(L)、圆叶(R),平均叶长,:植株中上部第8-10节复叶中间小叶的平均叶长(cm),平均叶宽,:植株中上部第8-10节复叶中间小叶的平均叶宽(cm),42,统计分析,利用Windows QTL Cartographer V2.0进行复合区间作图扫描农艺性状的QTLs,以似然比LR(Likehood Ratio)大于11.5,即对应LOD值大于2.5作为QTLs存在阈值,利用MapChart 2.1版本绘制连锁图谱,43,4.2 研究结果株系主要农艺性状分离情况,大豆重要农艺性状的QTL分析 ,一年两点,蛋白质含量、油分含量、蛋脂总量、单株荚数、单株粒重、百粒重、结荚习性、茸毛色、叶形、平均叶长等几个农艺性状指标均呈正态分布,株高、生育期、主茎节数、花色呈现左偏分布,分枝数呈现右偏分布,平均叶宽则呈现双峰分布,44,品质性状QTL分析,45,品质性状,油分含量,Satt094(11.0)-,Qsoil,1-(28.2)Satt556,Sat_001(0.0)-,Qsoil,2-(7.3)Sat_114,Satt257(17.0)-,Qsoil,3-(5.9)Satt551,Satt551(5.0)-,Qsoil,4-(18.8)Satt022,LOD值:,Qsoil,2(8.21),Qsoil,1(5.04),Qsoil,3(4.20),Qsoil,4(4.08),加性效应:,Qsoil,2(0.52),Qsoil,1(-0.43),Qsoil,3(0.32),Qsoil,4(0.32),可解释变异:,Qsoil,1(21.98),Qsoil,2(18.10),Qsoil,3(13.17),Qsoil,4(12.73),46,产量性状QTL分析,47,产量性状,单株荚数,Satt334(33.0)-,Qsppp,1-(5.4)Satt002,Satt002(2.0)-,Qsppp,2-(2.8)Sat_092,Sat_092(4.0)-,Qsppp,3-(9.0)Satt460,Satt173(12.0)-,Qsppp,4-(3.6)Satt581,LOD值:,Qsppp,2(4.53),Qsppp,3(4.27),Qsppp,1(3.46),Qsppp,4(3.30),加性效应:,Qsppp,1(-6.34),Qsppp,2(-5.78),Qsppp,3(-5.19),Qsppp,4(-4.91),可解释变异:,Qsppp,1(12.67),Qsppp,2(9.52),Qsppp,3(8.94),Qsppp,4(8.11),48,形态性状QTL分析,49,形态性状QTL分析,50,形态性状QTL分析,51,QTL分析结果与国内外QTL分析结果比较,与国内比较,与国外比较,连锁群,NEAUSRI,国外公共图谱,A1,百粒重、平均叶宽,B1,百粒重、株高,C1,单株粒重,C2,单株粒重、生育期,N,蛋白质含量,O,百粒重、蛋白质含量,52,五、大豆SMV消减文库构建及EST表达谱分析,53,种植抗大豆花叶病毒病品种8143,材料,一对真叶展开,接种花叶病毒1号株系,不接种花叶病毒1号株系,每隔24h取样,连续8次,液氮速冻,-70冰箱保存备用,5.1 研究方法,54,方法,接种样本,总RNA的提取,取样,mRNA的纯化,DNA污染的去除,抑制消减杂交(SSH),SSH扩增产物的克隆,SSH扩增产物的纯化,纯化产物与载体的连接,大肠杆菌感受态细胞的制备,转化与阳性克隆的筛选,测序及序列、表达谱分析,55,图1 大豆总的RNA提取图谱,1:未诱导样本的总RNA,2:诱导样本的总RNA,由图可知,提取的总RNA完整无降解,适合下一步操作。,大豆8143总RNA的提取结果,5.2 研究结果,1,2,56,大豆8143的mRNA纯化结果,图2 大豆mRNA的纯化图谱,1:未诱导样本的mRNA,2:诱导后样本的mRNA,纯化的mRNA在琼脂糖凝胶电泳上为弥散状, 紫外分光光度计检测260/280接近2.0,证明polyA 质量较好,57,大豆8143诱导前后的双链cDNA合成结果,图3 cDNA二链合成图谱,1:未诱导样本的driver cDNA 2:诱导后样本的tester cDNA,1,2,M,58,酶切结果分析,图4 cDNA酶切图谱,1:未经酶切的tester cDNA,2:酶切后的tester cDNA,对合成的tester cDNA双链用Rsa酶切,由图可见酶切后的片段小于未酶切的tester cDNA片段,酶切效果较好,可用于下一步接头连接。,1,2,M,59,差异表达消减效率分析,图5 消减后PCR扩增图谱,1:差减样本的第一次PCR结果 2:未差减样本的第一次PCR结果,3:差减样本的第二次PCR结果 4:未差减样本的第二次PCR结果,由图分析可知,抑制消减杂交有效富集了诱导后大豆8143差异表达的cDNA片段,1,2,3,4,M,60,连接转化与质粒文库滴度计算,上:转化后大肠杆菌DH5在100mg/ml Amp的LB培养基的生长,下左:未转化的DH5在100mg/ml Amp的LB培养基的生长,下右:未化的DH5在无Amp的LB培养基的生长,61,序列测定,挑取阳性克隆随机送交测序,64,个,ESTs,片段中最短的为,136bp,,最长的,691bp,,平均长度为,456bp,,有,41,条序列带有,poly,(,A,),将测序结果到,GenBank,进行,Blastn,和,Blastx,比对,其中,49,个有比较明确的比对结果,62,同源基因种类,表达谱分析,63,同源基因种类,表达谱分析,64,六、,大豆功能基因转化研究,65,抗牛巴氏杆菌性肺炎疫苗基因对大豆遗传转化的研究,66,实验,材料,植物材料,选用11个 全国不同积温带的大豆主栽品种作为本研究的试材,有合丰25、合丰35、黑农35、黑农42、东农42、东农163、黑河99-1201、绥农10、绥农14、吉林21、辽豆1号,质粒与根癌农杆菌菌株,LBA4404、AGL1和EHA101,67,68,七、大豆资源分析,69,7.1 大豆灰斑病种质资源遗传多样性的RAPD和SSR分析,研究材料和方法,94份大豆灰斑病抗病种质资源的品种品系,RAPD、SSR(AGE & PAGE),统计分析,70,7.2 研究结果,根据大豆灰斑病种质资源10个生理小种的抗感鉴定结果与RAPD和SSR的分子数据,得到了许多与各生理小种专化抗性有关的分子标记,黑龙江省大豆灰斑病种质资源的遗传基础狭窄,急需拓宽,以育出抗性更强、抗谱更广、抗病更持久的品种,71,新的遗传相似系数的提出,Chen Qingshans coefficient(CHEN):,Ccij=2(a+d)/(2(a+d)+b+c),Sorensens coefficient (SOREN):,Scij=2a/(2a+b+c),Jaccards coefficient (JACCA):,Jcij= a/(a+b+c),Simple matching coefficient (MATCH):,SMcij=(a+d)/( a+b+c+d),Yule coefficient (YULE):,YMcij=(a*d-b*c)/(a*d+b*c),Nei & Lis genetic distance (NEI):,NLcij=2a/(a+b)+(a+c),Baroni-Urbani Buser (BARONI):,BUBcij=(a*d)(1/2)+a)/ (a+b+c+ (a*d)(1/2),72,特异性指数的提出,CHEN Speciality Index(CHEN-SI),CHEN-SIi=(1/(Nij/Mj)/(m*n),(i=1,2,3.m; j=1,2,3.n),Nij为第i个个体在j位点的等位基因类型在m个个体中的分布总数。,Mj为第j位点存在的等位基因总数。在显性分子标记数据中为m个,,对于共显性分子标记数据中考虑到数据缺失,少于m个,73,Genetic Statistics 2.5,74,Press Germplasm and Population Information,75,Press Locus Information,76,Press Soft Story,77,Press F1,78,正在进行的国家和省内研究项目,转基因抗食心虫大豆的研究,利用大豆生物反应器生产疫苗蛋白的研究,大豆动态性状遗传标记的研究,生态性状基因的差异表达及克隆,疫霉根腐病广谱型抗性基因的遗传标记,抗食心虫基因的遗传标记,大豆异黄酮遗传标记的研究,大豆病毒病种粒斑驳遗传标记的研究,79,谢谢大家!,80,
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