第五章 种子的扩大培养

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级, 64282790,行政楼,419,Email:,shaobingu,基因工程菌发酵, 种子的扩大培养,种子扩大培养的目的与要求,种子制备实例,(,不同菌种和产品,),种子制备的技术概要,种子的扩大培养,内容提要, 种子扩大培养的目的与要求,种子的扩大培养,一、几个概念, 种子扩大培养的目的与要求,种子的扩大培养,一、几个概念,2.,接种量：放罐的种子罐的培养液体积除以接种后培养液,的体积的百分数,3.,种子级数：种子在种子罐中需扩大培养的次数,4.,发酵级数：种子级数加一,5.,种龄：生产种子的培养时间, 种子扩大培养的目的与要求,二、,种子扩培的目的,三、,种子的要求（,活力、状态、数量、纯度、抗性,）, 种子制备过程举例,一、谷氨酸生产的种子制备,二、青霉素生产的种子制备, 种子制备过程举例,一、谷氨酸生产的种子制备,种子制备,1.,种子制备的基本流程, 种子制备过程举例,一、谷氨酸生产的种子制备,2.,实验室阶段,斜面,(AS1.299),不超过,3,次, 种子制备过程举例,一、谷氨酸生产的种子制备,2.,实验室阶段,一级种子（摇瓶）,(1),培养基：,葡萄糖,2%,，尿素,0.5%,，,玉米浆,2.5%,，,K,2,HPO,4,0.1%,(3),培养基特点：,有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本,接近于发酵培养基,实验室,的培养条件接近发酵,(2),培养条件：,于,1000ml,三角瓶中，装液,200-250ml,32,培养,12h, 种子制备过程举例,一、谷氨酸生产的种子制备,(1),培养基：,和一级种子相似，葡萄糖用,水解糖,代替， 浓度为,2.5%,(3),培养基特点：,有利于长菌体，使用原料更,接近于发酵培养基,车间的培养条件也更接近于生产,(2),培养条件：,在种子罐中培养，,32,培养,7-10,个小时, 7.0-7.2,时结束，,6.887.0-7.2,活力旺盛,种子的扩大培养,4.,种子质量,第二节 种子制备过程举例,一、谷氨酸生产的种子制备,2004 34(3),何宁, 种子制备过程举例,二、青霉素生产的种子制备,青霉,营养体为,无色或淡色的菌,丝体,包括基质,菌丝和气生菌丝,.,在气生菌丝上,产生简单的长而,直立的,分生孢子梗,顶端以特殊的对称或不对称的扫帚状的方式分支,称为,帚状枝,.,分支为,多极的分生孢子梗最后产生许多瓶梗,在瓶梗上着生分生孢子链,.,繁殖体,分生孢子,为球形至卵形,呈绿色,蓝色或黄色,即通常看到的各种青霉菌落特有的颜色,., 种子制备过程举例,二、青霉素生产的种子制备,种子制备, 种子制备过程举例,二、青霉素生产的种子制备,(1),培养基：,甘油,、,葡萄糖,、,蛋白胨,等,(3),培养基特点：,有利于长孢子，用量少而精细,(2),培养条件：,25,、,7,天,注意湿度,50%,左右, 种子制备过程举例,二、青霉素生产的种子制备,(1),培养基：大米及氮源（玉米浆）,(3),培养基特点：,成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的,传质，营养适当（要求大米的白点小）,有利于孢子的生长,(2),培养条件：,25,、,7,天，控制湿度,(4),生长斜面要求：,1,粒米含,1.4*10,6,个孢子, 种子制备过程举例,二、青霉素生产的种子制备,(1),培养基,:,（葡萄糖,/,蔗糖）玉米浆,(3),接种量,:,200,亿孢子,/,吨,(2),培养条件,:25,、,40h,(4),目的求,:,孢子萌发、,长菌体,3.,生产车间阶段,二级种子,(1),培养基,:,同上,(3),接种量,:,10%,(2),培养条件,:25.,10-14h,(,生产车间阶段,), 种子制备过程举例,二、青霉素生产的种子制备,4.,种子质量要求,(1),菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于,期,注：青霉素发酵菌丝体的生长共分为,6,个期，,长菌丝为主, ,产单位为主；,放罐,或者,:(1),菌落生长繁殖期：孢子发芽，分枝旺盛，菌浓增加快，染色深。,(2),分泌期：菌落生长趋于减弱，补料加以调控，加入前体，保证产单位。,(3),菌落自溶期：菌落衰老（应在此之前做好放罐，保证提炼不乳化）。, 种子制备过程举例,a.,菌种活化及逐级扩培,b.,培养基设计原则,c.,种子质量,(,质和量,),d.,扩培阶段,三、两种生产种子制备工艺的简单比较,a.,培养物选择不同,b.,培养基设计不同,c.,扩培过程,1.,相同之处,2.,相异之处, 种子制备技术概要,一、种子制备的基本过程, 米孢子,母瓶,子瓶,一级种子罐 发酵罐,二级种子罐,三级种子罐,种子的扩大培养,第三节 种子制备技术概要,一、种子制备的基本过程,（实验室扩培）,（活化）,（生产车间扩培）,（保藏）,（接种发酵罐）, 种子制备技术概要,一、种子制备的基本过程,1.,实验室阶段,不用种子罐,，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在,菌种室,完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。,种子的扩大培养, 种子制备技术概要,一、种子制备的基本过程,2.,生产车间阶段,种子培养,在种子罐,里面进行，一般在工厂中归为,发酵车间管理,，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。, 种子制备技术概要,二、实验室阶段种子制备,1.,培养物选择的原则, 种子制备技术概要,二、实验室阶段种子制备,1.,培养物选择的原则,b.,获得一定数量和质量的,菌丝体,(,链霉素、卡那链霉素,), 种子制备技术概要,二、实验室阶段种子制备,2.,培养基选择的原则, 种子制备技术概要,二、实验室阶段种子制备,3.,起始接种物的传代问题,活化斜面,活化斜面,种子液,斜面,种子液, 种子制备技术概要,三、生产车间阶段种子制备,1.,培养物选择的原则,（染菌、单罐产量、设备利用）, 种子制备技术概要,三、生产车间阶段种子制备,2.,培养基选择的原则, 斜面 种子罐 发酵,麦芽汁 麦汁,蔗糖,2.5-5%,20%,NH,4,NO,3,0.225% 0.11%,K,2,HPO,4,0.03%,MgSO,4,.H,2,O 0.025% 0.025%,KCl,0.015%,琼脂,2%,种子的扩大培养,第三节 种子制备技术概要,三、生产车间阶段种子制备,2.,培养基选择的原则,(3),培养基选择原则实例,柠檬酸发酵,/,蔗糖为原料, 斜面 种子罐 发酵,麦芽汁 麦汁,薯干粉,10% 22-28%,(NH,4,),2,SO,4,0.5%,琼脂,2%,种子的扩大培养,第三节 种子制备技术概要,三、生产车间阶段种子制备,2.,培养基选择的原则,(3),培养基选择原则实例,柠檬酸发酵,/,薯干粉, （小罐）,发酵,例,2.,青霉素：三级发酵,一级种子 （小罐）,二级种子（中罐）,发酵,(1),定义：一般由,菌体培养,开始计算发酵级数，但工厂多从,第一级种子罐,开始计算发酵级数,种子的扩大培养,第三节 种子制备技术概要,三、生产车间阶段种子制备,3.,发酵级数的确定, 般,2-4,级。,在发酵产品的放大中,，,反应级数的确定是非常重要的一个方面,种子的扩大培养,第三节 种子制备技术概要,三、生产车间阶段种子制备,3.,发酵级数的确定,(2),发酵级数确定的依据, 发酵科技通讯，,2003,7, （英国）,1,，蛋白胨（日本），琼脂粉（日本）,1.8,， 无机盐,斜面,添加,0.1,的口服葡萄糖，其余同上,一级,口服葡萄糖,3,，,玉米浆,2.4,，尿素,0.65,，无机盐等,1200 ml /5000 ml,二级,玉米淀粉双酶糖,2.0,，,玉米浆,2.0,，,甘蔗糖蜜,1.0,尿素,0.35,， 无机盐等,1.2 / 2 m,3,三级,玉米淀粉双酶糖,4.0,，,玉米浆,1.5,，,甘蔗糖蜜,1.0,液氨，复合维生素,01 mg/L,，,无机盐等,12 / 20 m,3,发酵,玉米淀粉双酶糖,13-14,，,玉米浆,0.06-0.08,，,甘蔗糖蜜,1.0,液氨，维生素,50 g,，,无机盐等,154 / 240 m,3,培养基成分表,种子的扩大培养,采用三级种子的谷氨酸发酵工艺,李文东,， 发酵科技通讯，,2003,7, 发酵科技通讯，,2003,7, 种子制备技术概要,三、生产车间阶段种子制备,4.,接种量的确定, 中国油脂，,2002,亚麻酸是一种人体必需,多价不饱和脂肪酸,，它是人体前列腺素的前体物质，在,预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病治疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤,等方面具有重要的生理功能。因发酵法生产,亚麻酸与从天然植物提取相比具有一系列优点，发酵法生产,亚麻酸成了当今研究的一个热点。,亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行，,丝状真菌的形态往往对发酵有较明显的影响,，而丝状真菌发酵,亚麻酸时菌丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。,种子的扩大培养,接种量, 种子制备技术概要,三、生产车间阶段种子制备,4.,接种量的确定,b,b,种子的扩大培养,接种操作, 种子制备技术概要,三、生产车间阶段种子制备,5.,种龄, 林产化学与工业，,2004,镜,检：,24,小时多个杆菌首尾相连成线形，处于繁殖旺盛期,30,小时开始出现芽孢,种子的扩大培养,种龄, 种子制备技术概要,四、,种子质量标准,（活力、状态、数量、纯度、抗性）, 低生长缓慢，高易引起自溶（,37,度，土霉素生产）,b.,湿度，大，孢子生长慢，小，孢子生长快,c.pH,（大量繁殖和酶合成，合适,pH,确保最大比速率和适当的菌量）,d.,通气与搅拌，应保证足够的通气，以保证种子代谢,3.,种龄、接种量、菌种培养保藏时间,4.,菌种本身,措施：定期稳定性检测，适宜的生长条件，种子无菌检查,种子的扩大培养,第三节 种子制备技术概要,五、,影响种子质量的因素, You !,