《化学生物学》课件Part 3

,第三专题 核酸化学,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,曲阜师范大学化学与化工学院,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三专题 核酸化学,曲阜师范大学化学与化工学院,*,2024/9/10,1,2024/9/10,2,核酸与蛋白质一样，是一切生物机体不可缺少的组成部分。,核酸是生命遗传信息的携带者和传递者，它不仅对于生命的延续，生物物种遗传特性的保持，生长发育，细胞分化等起着重要的作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传病、代谢病等也密切相关。,因此，核酸是现代生物化学、分子生物学和医学的重要基础之一。,2024/9/10,3,Friedrich Miescher,核酸的发现,DNA,的双螺旋结构,2024/9/10,4,内容,第一节 核酸的分类和组成,第二节 核酸的结构,第三节 核酸的性质,第四节 核酸碱基顺序分析,第五节 核酸测定方法,2024/9/10,5,核酸的分类,一,核酸的组成,二,第一节 核酸的分类和组成,2024/9/10,6,一、,核酸的分类,Deoxyribonucleic Acid,Ribonucleic Acid,2024/9/10,7,DNA,分子含有生物物种的所有遗传信息，分子量一般都很大。,DNA,为双链分子，其中大多数是链状结构大分子，也有少部分呈环状结构。,脱氧核糖核酸（,DNA,）,核糖核酸（,RNA,）,RNA,主要是负责,DNA,遗传信息的翻译和表达，分子量要比,DNA,小得多。,RNA,为单链分子。,根据,RNA,的功能，可以分为,mRNA,、,tRNA,和,rRNA,三种。,2024/9/10,8,二、 核酸的组成,核酸（,DNA,和,RNA,）是一种线性多聚核苷酸，它的基本结构单元是核苷酸。,核苷酸本身由核苷和磷酸组成,而核苷则由戊糖和碱基形成,DNA,与,RNA,结构相似，但在组成成份上略有不同。,核酸,核苷酸,磷酸,核苷,戊糖,碱基,2024/9/10,9,DNA,和,RNA,的基本化学组成,化学组成,DNA,RNA,碱基,嘌呤碱,腺嘌呤（,A,）,鸟嘌呤,(G),腺嘌呤（,A,）,鸟嘌呤,(G),嘧啶碱,胞嘧啶,(C),胸腺嘧啶,(T),胞嘧啶,(C),尿嘧啶,(U),戊糖,D-2-,脱氧核糖,D-,核糖,酸,磷酸,磷酸,2024/9/10,10,1,核酸的结构单元,-,核苷酸,2024/9/10,11,（,1,）组成核酸的碱基,腺嘌呤,鸟嘌呤,2024/9/10,12,尿嘧啶 胞嘧啶 胸腺嘧啶,2024/9/10,13,碱基的结构特征,2024/9/10,14,碱基都具有芳香环的结构特征。嘌呤环和嘧啶环均呈平面或接近于平面的结构。,碱基的芳香环与环外基团可以发生酮式,-,烯醇式或胺式,-,亚胺式互变异构。,2024/9/10,15,核苷酸,的,紫外吸收能力,嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系，在紫外区有吸收（,260 nm,左右）。,2024/9/10,16,（,2,）戊糖,组成核酸的戊糖有两种。,DNA,所含的糖为,-D-2-,脱氧核糖；,RNA,所含的糖则为,-D-,核糖。,2024/9/10,17,（,3,）核苷,nucleoside,糖与碱基之间的,C-N,键，称为,C-N,糖苷键,。,2024/9/10,18,（,4,）核苷酸,nucleotide,核苷酸是核苷的磷酸酯。作为,DNA,或,RNA,结构单元的核苷酸分别是,5-,磷酸,-,脱氧核糖核苷和,5-,磷酸,-,核糖核苷。,2024/9/10,19,2,核苷酸的衍生物,（,1,）,ATP (,腺嘌呤核糖核苷三磷酸,),2024/9/10,20,ATP,是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生物。它的结构如下：,2024/9/10,21,ATP,的,水解,ATP,分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。,ATP,水解时,可以释放出大量自由能。,2024/9/10,22,(2)GTP (,鸟嘌呤核糖核苷三磷酸,),GTP,是生物体内游离存在的另一种重要的核苷酸衍生物。它具有,ATP,类似的结构,也是一种高能化合物。,GTP,主要是作为蛋白质合成中磷酰基供体。在许多情况下, ATP,和,GTP,可以相互转换。,2024/9/10,23,（,3,）,cAMP,和,cGMP,cAMP(3,5-,环腺嘌呤核苷一磷酸,),和,cGMP( 3,5-,环鸟嘌呤核苷一磷酸,),的主要功能是作为细胞之间传递信息的信使。,2024/9/10,24,cAMP,和,cGMP,的环状磷酯键是一个高能键。在,pH 7.4,条件下, cAMP,和,cGMP,的水解能约为,43.9 kJ /mol,，比,ATP,水解能高得多。,2024/9/10,25,3,多聚核苷酸,多聚核苷酸是通过核苷酸的,5,-,磷酸基与另一分子核苷酸的,C,3,-OH,形成磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,由脱氧核糖核苷酸聚合而成的称为,DNA,链；,由核糖核苷酸聚合而成的则称为,RNA,链。,2024/9/10,26,多聚核苷酸的特点,在多聚核苷酸中，两个核苷酸之间形成的磷酸二酯键通常称为,53,磷酸二酯键。,多聚核苷酸链一端的,C,5,带有一个自由磷酸基，称为,5-,磷酸端（常用,5-P,表示）；另一端,C,3,带有自由的羟基，称为,3-,羟基端（常用,3-OH,表示）。,多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是,53,或是,35,。,2024/9/10,27,方向性,在多聚核苷酸（,DNA,或,RNA,）链中，由于构成核苷酸单元的戊糖和磷酸基是相同的，体现核苷酸差别的实际上只是它所带的碱基，所以多聚核苷酸链结构也可表示为：,在讨论有关核酸问题时，一般只关心其中碱基的种类和顺序，所以上式可以进一步简化,2024/9/10,28,DNA,的结构,一,RNA,的结构,二,第二节 核酸的结构,2024/9/10,29,多聚核苷酸是由四种不同的核苷酸单元按特定的顺序组合而成的线性结构聚合物，因此，它具有一定的核苷酸顺序，即碱基顺序。,核酸的碱基顺序是核酸的一级结构。,DNA,的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于,DNA,分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。而,mRNA(,信息,RNA),的碱基顺序，则直接为蛋白质的氨基酸编码，并决定蛋白质的氨基酸顺序。,2024/9/10,30,一、,DNA,的结构,1953,年，,J. Watson,和,F. Crick,在前人研究工作的基础上，根据,DNA,结晶的,X-,衍射图谱和分子模型，提出了著名的,DNA,双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。,2024/9/10,31,1,DNA,双螺旋结构的特点,DNA,分子由两条,DNA,单链组成。,DNA,的双螺旋结构是分子中两条,DNA,单链之间基团相互识别和作用的结果。,双螺旋结构是,DNA,二级结构的最基本形式。,2024/9/10,32,碱基的相互结合具有严格的配对规律，即腺嘌呤（,A,）与胸腺嘧啶（,T,）结合，鸟嘌呤（,G,）与胞嘧啶（,C,）结合，这种配对关系，称为碱基互补。,A,和,T,之间形成两个氢键，,G,与,C,之间形成三个氢键。,2024/9/10,33,DNA,双螺旋结构的要点,（,1,）,DNA,分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链,(,简称,DNA,单链,),组成。,两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反,，,即其中一条链的方向为,53,，而另一条链的方向为,35,。,2024/9/10,34,（,2,）嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成,90,角。,2024/9/10,35,（,3,）螺旋横截面的直径约为,2 nm,，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为,0.34 nm,，每,10,个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈）高度为,3.4nm,。,2024/9/10,36,（,4,）两条,DNA,链相互结合以及形成双螺旋的力是链间的碱基对所形成的氢键。,在,DNA,分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,2024/9/10,37,2,DNA,双螺旋的稳定性,DNA,双螺旋结构在生理条件下是很稳定的。,维持这种稳定性的因素包括：两条,DNA,链之间形成的氢键；,由于双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响；介质中的阳离子（如,Na,+,、,K,+,和,Mg,2+,）中和了磷酸基团的负电荷，降低了,DNA,链之间的排斥力、范德华引力等。,改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。,2024/9/10,38,3.DNA,的三螺旋结构,1957,年，,A. Rich,等用两条多聚尿嘧啶核苷酸链和一条多聚腺嘌呤核苷酸链合成出一种三链结构的物质，并提出了,DNA,三螺旋结构的概念。,近年来对于,DNA,三螺旋结构和功能的研究已经取得了很大的进展。,DNA,的三螺旋结构与双螺旋结构相似，都是通过,DNA,单链之间形成氢键实现的。,2024/9/10,39,DNA,三螺旋结构的三种示意图,2024/9/10,40,超螺旋结构,2024/9/10,41,4.DNA,的超螺旋结构,超螺旋（,Supercoil,），简单地说就是,螺旋的螺旋,。超螺旋的形成不是一个随机过程，而是当,DNA,存在一定张力时才会形成。,由于,DNA,双螺旋的盘绕过度或不足，使,DNA,分子处于一种张力状态，在封闭环状,DNA,分子中的这种张力不能释放出来，就会形成超螺旋,。,2024/9/10,42,超螺旋的形式,2024/9/10,43,G,除了可以和,C,配对外，也可以和,U,配对。,2024/9/10,44,二、,RNA,的结构,RNA,是单链分子，因此，在,RNA,分子中，并不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。在,RNA,的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象,DNA,中严格。,G,除了可以和,C,配对外，也可以和,U,配对,。,G-U,配对形成的氢键较弱。,RNA,分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成突环。这种结构可以形象地称为,“,发夹型,”,结构。,2024/9/10,45,单链,双螺旋,突环,2024/9/10,46,1.mRNA,的结构,mRNA (,信使,RNA),：约占总,RNA,的,5%,，但种类较多，哺乳动物细胞约有几万种不同的,mRNA,。,mRNA,在体内代谢很快，细菌,mRNA,平均半衰期仅为,2,分钟，一些很不稳定的细菌,mRNA,的转录尚未完成，已从,5,端开始降解，实际上并没有形成完整的,mRNA,分子。,真核细胞,mRNA,半衰期较原核细胞长，但平均也仅有,5,小时。不同细胞的,mRNA,的链长和分子量差异很大。,它的功能是将,DNA,的遗传信息传递到蛋白质合成基地,-,核糖核蛋白体,。,2024/9/10,47,（,1,）,mRNA,的,“,帽结构,”,真核细胞,mRNA 5,-,末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为“帽结构”。,（,2,）,mRNA,的,“,尾结构,”,极大多数真核细胞,mRNA,在,3,-,末端有一段长约,200,核苷酸的,polyA,，称为 “尾结构”。,2024/9/10,48,帽结构,尾结构,2024/9/10,49,许多,rRNA,的一级结构及由一级结构推导出来的二级结构都已阐明，,rRNA,分子中有非配对的单链区以及配对的双链区相间排列，组成,发卡（,Hairpin,）、突环,(bulge),、内部环（,Internal loop,）、多分支环和假结,等二级结构。,2.rRNA,的结构,2024/9/10,50,大肠杆菌,16S rRNA,的二级结构,大肠杆菌,16S rRNA,由,1542,个核苷酸构成，二级结构可以分成为,4,个功能域,2024/9/10,51,tRNA,的二级结构都呈”三叶草”形状，在结构上具有某些共同之处，一般可将其分为五臂四环：包括氨基酸接受区、反密码区、二氢尿嘧啶区、,T,C,区和可变区。除了氨基酸接受区外，其余每个区均含有一个突环和一个臂。,3.tRNA,的结构,2024/9/10,52,tRNA,中的稀有碱基,2024/9/10,53,DNA,复制、转录、翻译及蛋白质合成,2024/9/10,54,核酸的,两性性质,一,核酸的,水解性质,二,第三节 核酸的性质,核酸的,变性与复性,三,2024/9/10,55,与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。,由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，嘌呤碱基和嘧啶碱基都具有弱碱性，所以核酸的等电点比较低。如,DNA,的等电点为,4,4.5,，,RNA,的等电点为,2,2.5,。,RNA,的等电点比,DNA,低的原因，是,RNA,分子中核糖基,2-OH,通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。,DNA,没有这种作用。,一、核酸的两性性质及等电点,2024/9/10,56,二,、核酸的水解,（,1,）酸或碱水解,核酸分子中的,磷酸二酯键,可在酸或碱性条件下水解切断。,DNA,和,RNA,对酸或碱的耐受程度有很大差别。例如，在,0.1 mol/L NaOH,溶液中，,RNA,几乎可以完全水解，生成,2-,或,3-,磷酸核苷；,DNA,在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与,RNA,核糖基上,2-OH,的邻基参与作用有很大的关系。在,RNA,水解时，,2-OH,首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。,2024/9/10,57,核糖核酸的碱水解反应,2024/9/10,58,（,2,）酶水解,生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。,以,DNA,为底物的,DNA,水解酶（,DNases,）和以,RNA,为底物的,RNA,水解酶（,RNases,）。,根据核酸水解酶的作用方式又可将其分作两类：,2024/9/10,59,核酸外切酶（如牛胰核糖核酸酶、核糖核酸酶,T,1,、核糖核酸酶,U,2,、牛胰脱氧核糖核酸酶、牛脾脱氧核糖核酸酶）,核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（,3-,端或,5-,端）开始，逐个水解切除核苷酸。,2024/9/10,60,核酸内切酶,如牛脾磷酸二酯酶、蛇毒磷酸二酯酶和限制性内切酶。,核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。如牛胰核糖核酸酶催化的核酸水解反应，特异性作用于,嘧啶核苷酸的,C-3,位磷酸与其相邻核苷酸,C-5,位构成的磷酸酯键，,产生,3-,嘧啶单核苷酸和,3-,为嘧啶核苷酸的寡核苷酸,2024/9/10,61,限制性核酸内切酶,这种酶可,以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位，它有严格的碱基专一性,。,当作用于双链,DNA,时，此酶可以交错地切断两条链（此时产生两条互补的单链，称为粘性末端），也可以不交错切割（切开的两个末端称为平端），这类酶在降解,DNA,时能识别,4,6,个特异性脱氧核苷酸顺序。,2024/9/10,62,EcoR,水解,DNA,的作用方式,2024/9/10,63,三、核酸的变性、复性与杂交,(1),核酸的变性,核酸的变性是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构,(,碱基顺序,),保持不变。,能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。,2024/9/10,64,RNA,本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有,DNA,那样明显。,利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。例如，天然状态的,DNA,在完全变性后，紫外吸收,(260 nm),值增加,25,40%.,而,RNA,变性后，约增加,1.1%,。这种现象称为增色效应,.,2024/9/10,65,DNA,变性,2024/9/10,66,DNA,变性的特征,DNA,的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将引起,DNA,变性的温度称为融点，用,T,m,表示。,一般,DNA,的,T,m,值在,70-85,C,之间。,DNA,的,T,m,值与分子中的,G,和,C,的含量有关。,2024/9/10,67,当,DNA,的稀盐溶液加热到,80-100,时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。,DNA,变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如紫外吸收,(260 nm),值升高,粘度降低等。,2024/9/10,68,(2),核酸的复性,变性,DNA,在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。,DNA,复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。,DNA,复性的程度、速率与复性过程的条件有关。,将热变性的,DNA,骤然冷却至低温时，,DNA,不可能复性。但是将变性的,DNA,缓慢冷却时，可以复性。,分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，,DNA,的复性也与它本身的组成和结构有关。,2024/9/10,69,DNA,复性,2024/9/10,70,(3),核酸的杂交,热变性的,DNA,单链，在复性时并不一定与同源,DNA,互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源,DNA,单链形成双螺旋结构。,这样形成的新分子称为杂交,DNA,分子。,DNA,单链与互补的,RNA,链之间也可以发生杂交。,核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。,2024/9/10,71,核酸的杂交,2024/9/10,72,第四节 核酸碱基顺序分析,DNA,的体外合成过程,聚合酶链反应,（,polymerase chain reaction, PCR,）,凯利,穆利斯,DNA,聚合酶的催化,以目的,DNA,为模板,按照碱基互补配对原则,在引物的引导下,单核苷酸聚合形成新,DNA,链,PE310,基因分析仪,仪器的组成,主机：,主要包括电泳系统、激光器和荧光检测系统 ；大致可分为自动进样器区 、凝胶块区 和检测区等结构功能区,微型计算机,各种应用软件,DNA,测序图,2024/9/10,76,分光光度法,荧光法,共振瑞利散射法,第五节 核酸测定方法,测糖法,染料结合法,荧光试剂,染料等在核酸表面的组装,2024/9/10,77,RNA,组成与结构,DNA,组成与结构,2024/9/10,78,