微生物的遗传变异与菌种选育

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,第六章 微生物的遗传变异与菌种选育,在应用微生物加工制造和发酵生产各种食品的过程中，要想有效地大幅度提高产品的产量、质量和花色品种,首先必须选育优良的生产菌种，才能达到目的。而优良菌种的选育是在微生物遗传变异的基础上进行的。遗传和变异是相互关联，同时又相互矛盾对立的两个方面，在一定条件下，二者是相互转化的。认识和掌握微生物遗传变异的规律是搞好菌种选育和关键。,1,本章主要内容,微生物遗传变异的基本原理,关于微生物遗传变异的物质基础及其存在形式。,关于微生物基因突变的基本原理（类型、特点和机制）。,关于微生物基因重组的基本原理（方式和特点）。,微生物菌种的选育,关于野生型微生物菌菌株分离、筛选与纯化。,关于微生物的诱变育种的工作程序和方法步骤。,关于营养缺陷型突变菌株的筛选方法和具体应用。,原生质体融合育种技术的操作程序。,基因工程育种技术的操作步骤和取得的成就。,微生物菌种退化的原因；掌握菌种复壮的方法、防止菌种退化的措施以及菌种保藏的方式和原理。,2,第一节 微生物遗传变异的物质基础,证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验,肺炎双球菌的转化实验,噬菌体的感染实验,烟草花叶病毒的拆开与重组实验,3,肺炎双球菌的转化实验,注射,R,型活菌 小鼠不发病（存活）,注射,S,型灭活菌 小鼠不发病（存活）,注射,S,型活菌 小鼠发病死亡,注射,R,型活菌,+,S,型死菌,小鼠发病死亡 心血分离到,S,型活菌,动物试验,热致死,S,型菌,培养皿培养,无菌落生长,R,型活菌,培养皿培养 培养出,R,型菌落,热致死,S,型菌,+,R,型活菌,培养皿培养 培养出大量,R,型和,S,型菌落,R,型活菌,+,S,菌抽取提物,培养皿培养 培养出大量,R,型和,S,型菌落,细菌培养试验,4,噬菌体的感染实验,1952,年侯喜,(,A. Hershey),和蔡斯,(,M. Chase),利用示踪元素，对大肠杆菌,T2,噬菌体进行了这类实验。,先用含有,35,S,和,32,P,两种元素的培养基培养大肠杆菌，然后让,T2,噬菌体侵染培养后的大肠杆菌，从而使,T2,噬菌体打上,35,S,和,32,P,的标记。,让这种,T2,噬菌体侵染不含标记元素的大肠杆菌，并在,T2,噬菌体完成了吸附和侵入后，,强烈搅拌,洗涤,，以便使吸附在菌体外表的,T2,噬菌体蛋白质外壳脱离细胞并均匀分布，再进行离心沉淀，分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记。,结果发现，几乎全部,35,S,都在上清液中，而几乎全部,32,P,和细菌一起出现在沉淀物中。,5,烟草花叶病毒的拆开与重组实验,1956,年，美国的法朗克-康勒特,(,Fraenkel,-,Conrat),将烟草花叶病毒拆成,RNA(,因该病毒不含,DNA),和蛋白质，并分别对烟草进行感染实验；,结果发现只有,RNA,能感染烟草，并在感染后的寄主中分离到完整的具蛋白质外壳的烟草花叶病毒。,后来他又将甲、乙两种变种的烟草花叶病毒拆开，在体外分别将甲病毒的,RNA,和乙病毒的蛋白质结合，将乙病毒的,RNA,和甲病毒的蛋白质结合进行重组。,接着他把这些经过重组的病毒分别感染烟草。结果从寄主分离所得的病毒蛋白质均取决于相应病毒的,RNA,。,证明了核酸,(,RNA),是烟草花叶病毒的遗传物质基础。,6,二、遗传物质在细胞中的存在方式,（一）细胞水平,从细胞水平来看，细胞核；除此之外，在细胞质中存在着一些能自我复制的遗传物质，一般称这部分,DNA,为质粒。,（二）亚细胞核水平,真核微生物的细胞核有核膜包围，形成具有完整形态、在光学显微镜下清晰可见的细胞核，核内,DNA,与组蛋白结合在一起构成染色体。 （三）分子水平,DNA（ RNA）,在,DNA,大分子上存在着决定某些遗传性状的特定区段，即所谓基因一个基因含若干核苷酸碱基组成的三联密。,四种核苷酸，按其排列组合方式的不同，可编出三联密码 4,3,64个，用于决定组成蛋白质的20 种氨基酸顺序。起始密码（,AUG）,和终止密码（,UAA、UGA,和,UAG）。,7,第二节,微生物的基因突变,一、基因突变的类型,基因突变的类型是多种多样的，按突变体表型不同，可分为以下几种类型：,（,1,）,形态突变型。,（,2,）,条件致死突变型。,（,3,）,营养缺陷突变型。,（,4,）,抗性突变型。,（,5,）,抗原突变型。,（,6,）其他突变型。,二、基因突变的特点,整个生物界，由于它们遗传变异的物质基础是相同的，因此显示在遗传变异的本质上都具有相同的规律，这在基因突变的水平上尤其突出。,（,1,）,不对应性。,（,2,）,自发性。,（,3,）,稀有性。,（4）独立性。,（5）诱变性。,（6）稳定性。,（7）可逆性。,三 、基因突变的机理,（一）诱发突变及其机理,1,碱基对的置换,直接引起置换的诱变剂 （亚硝酸类、烷化剂类）,间接引起置换的诱变剂,（碱基类似物）,2,移码突变,3 染色体畸变,（二）自发突变的机制,1,背景辐射和环境中多因素低剂量的诱变效应,2,微生物自身代谢产物的诱变效应,3,互变异构效应,4,环状突出效应,8,碱基对的置换,碱基对的置换可分成两个亚类：一类是,DNA,链上的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换，称为转换；另一类是,DNA,链上的一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换，称为颠换,A,：,T T,：,A,A T,C,：,G G,：,C,C G,双链,DNA,单链,DNA,（实线代表转换，虚线代表颠换）,9,直接引起置换的诱变剂,亚硝酸是一种对含有氨基的碱基对直接作用而诱发碱基对转换的诱变剂。它能使碱基中的氨基氧化脱氨，从而使腺嘌呤（,A）,变成次黄膘呤（,H），,胞嘧啶（,C）,变成尿嘧啶（,U），,而后由于,H,和,C,配对，,U,与,A,配对，因此当,DNA,再次复制时，,A:T,就转换为,G:C，,而,G:C,就转换为,A:T。,H:C,H:C,-G:C,H:C,G:C,A:T H:T-A:T,亚硝酸类引起的碱基对置换,O:A,T:A,（,颠换）,O:C,G:C,（,复原）,G:C RG:C O:C,O:T,A:T,（,转换）,O:G,C:G,（,颠换）,烷化剂是诱变育种极其重要的一类诱变剂，它们的化学结构都带有一个或多个活性烷基。所有这些物质通过烷化磷酸基形成烷化嘌呤和烷化嘧啶与,DNA,作用，特别是经常形成烷化鸟嘌呤。,烷化作用导致基因突变的机制尚未定论。 碱基类似物作用，引起碱基配对的错误,。,烷基在鸟嘌呤,引起,脱嘌呤作用，使鸟嘌呤从,DNA,链上脱落下来，进而引起,DNA,复制时碱基对的缺失和置换。,10,间接引起置换的诱变剂,A,:BU,/,G:BrU,G:BrU,-G:C,5,-,BU,A:T- A:BU- A:T,(a),G,:BrU,/,A:BU,A:BU-A:T,5,-,BrU,G:C-G:BrU -G:C,(b),5,-溴尿嘧啶的诱变效应,a.5,-,BU,以酮式掺入；,b.5,-,BrU,以烯醇式掺入,5,-氨基尿嘧啶（,5,-,AU,）、,8,-,氮鸟嘌呤（,8,-,NG,）、-,氨基嘌呤（,-,AP,）,及,6,-氮嘌呤（,6,-,NP,）,等。它们的作用是通过活细胞的代谢活动掺入到,DNA,分子中后，引起碱基对的置换，因此是间接的。在这些碱基类似物中，最常被应用的是,5,-溴尿嘧啶（,5,-,BrU,）,和,-,氨基嘌呤（,-,AP,）。,5,-,BrU,是,T,的代谢类似物。,5,-,BrU,以酮式状态时可以替代,T，,与,A,配对；,5,-,BrU,以烯醇式状态时替代,C,与,G,配对；,5,BrU,可以通过烯醇式和酮式结构的变化； 引起碱基对置换,。,11,移码突变,移码突变 这是指由一种诱变剂而引起,DNA,分子中的一个或少数几个碱基插入或缺失，从而使该部位后面全部遗传密码发生转录错误的一类突变。,吖啶类染料及其化合物是移码突变的有效诱变剂，例如三氨基吖啶，吖啶黄，吖啶橙，,5,-氨基吖啶。,吖啶类化合物的诱变机制目前还不很清楚。现普遍认为，由于吖啶类化合物是一种平面型三环分子结构，与一个嘌呤:嘧啶碱基对相似，因此能够嵌入两个相邻的,DNA,碱基对之间，造成双螺旋的部分解开，从而在,DNA,复制过程中，会使链上插入或缺失一个碱基，结果引起移码突变。,12,染色体畸变,染色体畸变是指由诱变剂引起,DNA,分子的大损伤，它包括染色体结构上的缺失、重复、易位及倒位等。,紫外线、,X,射线、,射线等射线及亚硝酸、烷化剂等均能引起染色体畸变，尤其是紫外线能引起,DNA,分子多处较大的损伤。,紫外线主要通过在同链,DNA,相邻的嘧啶间或在互补双链间形成以共价键结合的胸腺嘧啶二聚体，,微生物能以多种方式去修复被紫外线损作后的,DNA,，,主要方式有两种：,（1）光复活作用。,由于微生物中一般都存在着光复合作用，因此，用紫外线照射菌液时都须在红光下进行操作处理微生物，而后在暗室或用黑布包起来培养。,（2） 暗修复作用。也称切除修复作用。,X,射线和,射线为电离辐射，含有很高的能量，能产生电离作用，因而能直接或间接地改变,DNA,结构。直接的效应是碱基的化学键，脱氧核糖的化学键和糖酸相连接的化学键断裂；,13,第三节 微生物的基因重组,基因重组又称为遗传重组，它是指把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传型个体的过程。,重组是分子水平上的概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交，而一般所说的杂交是细胞水平上的概念。,杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。真核微生物中的有性杂交，准性生殖以及原核微生物中的转化、转导、接合和溶原转变等都是基因重组在细胞水平上的反映。,14,一、原核微生物的基因重组,（一）转化（,transtormation,）,受体菌直接吸收来自供体菌的,DNA,片段，通过交换组合把它整合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象，称为转化。转化后的受体菌，称为转化子。供体菌的,DNA,片段称为转化因子。,只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，进行转化作用。,转化过程大致是这样的：,从供体菌提取出转化因子双链,DNA,片段；,双链,DNA,片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合；,在结合位点上，双链,DNA,中的一条单链逐步降解，同时另一条链逐步进入受体细胞。, 进入受体细胞的,DNA,单链与受体菌染色体组上同源区段配对，而受体菌染色体组的相应单链片段被切除，并被进入受体细胞的,DNA,单链所取代，于是形成了杂种,DNA,区段；, 受体菌染色体进行复制，其中杂种区段被分离成两个，一个恢复，一个形成一个转化子。,15,一、原核微生物的基因重组,（二）转导（,transduction,）,通过缺陷型噬菌体或温和型噬菌体为媒介，将供体细菌细胞中,DNA,片段携带到受体细菌细胞中，从而使受体细菌获得供体细菌的某些遗传性状的现象，称为转导。,根据媒介噬菌体的不同，转导分普遍性转导和局限性转导两类。,1,普遍性转导 由缺陷型噬菌体误包（而非整合）供体细菌,DNA,中的任何一部分片段（包括核外遗传物质在内）后，当它再次感染受体细菌时，使后者获得了这部分遗传性状的现象，称为普遍性转导。它的转导频率为,10,5,10,8,。,2,局限性转导 由温和噬菌体侵染而形成的某一溶源细菌群被诱导裂解时，其中极少数个体的,DNA,可能与噬菌体,DNA,发生若干特定基因的交换，从而被整合到噬菌体的基因组上，当该噬菌体再次感染受体细菌时，就使受体细菌获得了这一特定遗传性状的现象，称为局限性转导，它的转导频率为,10,-6,。,16,一、原核微生物的基因重组,（三）接合（,conjugation,）,通过供体细菌和受体细菌完整细胞间的直接接触而传递大段,DNA,的过程，称为接合（有时也称杂交）。,在细菌中，接合现象研究最清楚的是大肠杆菌。发现能够进行接合现象的大肠杆菌有雄性与雌性之分，而决定它们性别的是由是否存在,F,因子所决定。,F,因子又称致育因子，是一种质粒，分子量为,5,10,7,道尔顿,；,雌性细菌不含,F,因子，称为,F,-,菌株,，,雄性细菌含有游离存在的,F,因子，称为,F,+,菌株,，,当,雄性细菌细胞中所含的,F,因子被整合在细胞核的,DNA,上，不呈游离状态存在称为,Hfr,菌株,（,高频重组菌株,）,；,有,时,被整合在细胞核,DNA,上,的,F,因子，从,DNA,上面脱落下来，呈游离存在，但在脱落时，,F,因子有时能带一小段细胞核,DNA,。,我们将这种含有游离存在的但又带有一小段细胞核,DNA,的,F,因子的细菌称为,F,菌株,。,接合的基本过程,滚环复制模型,接合的结果：,F,+,+ F,-,2 F,+,F,+ F,-,2 F,Hfr + F,-,多种情况,Hfr + F,-,Hfr,F,-（,多数情况下）,Hfr + F,-,Hfr,Hfr,（,少数情况下）,17,一、原核微生物的基因重组,（四）溶源性转变,宿主菌在感染温和噬菌体后，由于噬菌体,DNA,整合到核,DNA,后，导致宿主菌某些新的遗传性状表达，即所谓溶源性转变。,这是一种与转导相似但又有本质不同的现象。溶源转变与转导在本质上的不同，首先是它的温和噬菌体不携带有任何供体菌的基因，其次这种噬菌体是正常的完整的，而不是异常情况下产生的缺陷型噬菌体。,溶源转变的典型例子是不产毒素的白喉棒状杆菌（,Lorynebatcerium diphthariac,）,菌株被噬菌体侵染而发生溶源化时，会变成产毒素的致病菌株。其他如沙门氏菌、红霉菌、链霉菌等也具有溶源转变的能力。,18,二、真核微生物的基因重组,（一）有性杂交,在微生物的有性繁殖过程中，不同的性细胞间的接合，并随之发生染色体的重组，从而产生新遗传型后代的现象，称有性杂交。,凡是能产生有性孢子的酵母菌和霉菌，都能进行有性杂交。,有性杂交在生产实践中被广泛用于优良品种的培育。例如用于酒精发酵的酵母菌和用于面包发酵的酵母菌同属一种啤酒酵母（,Saccharomyces cerevisiae,）,的两个不同菌株，面包酵母的特点是对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生,CO2,多，生长快；而酒精酵母的特点是产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵力弱，所以酿酒厂生产酒精后的酵母，不能供面包厂作引子用。通过两者的杂交，就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。,19,二、真核微生物的基因重组,（二）准性生殖,准性生殖是一种类似于有性生殖但比它更为原始的一种生殖方式。是由两个非异配型核的细胞接合后，形成异核体细胞，两核能发生低频率的接合与交换，产生具有新性状的个体。其主要过程包括以下基本过程：,1菌丝联结 发生在一些形态上没有区别的，但在遗传性状上可以有差别的两个同种亲本的体细胞（单倍体）间。,2形成异核体 两个单倍体细胞经联结后，使原有的两个单倍体核集中到同一个细胞中，形成双相的异核体。异核体能够独立生活。,3核融合 在异核体中的双核融合，产生双倍体杂合子核。核融合后产生杂合子核的频率也是极低的，如构巢曲霉和米曲霉为 10,-5,10,-7,。,4体细胞重组和单倍体化 双倍体的杂合子极不稳定，在进行有丝分裂过程中，极少数核中的染色体会发生染色体交换和单倍体化，从而形成了极个别的具有新遗传性状的单倍体杂合子。,20,第四节,微生物的菌种选育,在微生物工业应用中， 微生物菌种工作主要包括以下四方面：, 菌种的分离筛选：挑选符合生产要求的菌种，这是选种工作的任务。, 菌种培育： 改良已有菌种的生产性能，使产品的质和量不断提高，或使它更适应于工艺的要求，这是育种工作的任务。, 菌种的保藏： 一切生产菌种都要使它避免死亡和生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。, 退化菌种的复壮： 如果发现菌种的生产性能下降，就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务。,21,一、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤,采 样,增殖培养,纯种分离,纯培养,生产性能测定,方法、地点、时间和周围环境记录,纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：,1,稀释分离法,2,平板划线分离法,涂菌,：,划线分离,：,分步划线法,；,一次划线法：,3,组织分离法,测定代谢产物或其它目的性状,22,（一）诱变育种的一般步骤和方法,出发菌株,同步培养,使菌细胞处于相同或接近的生理状态,单细胞（或单孢子）菌悬液的制备,单细胞或单孢子的意义,酵母或霉菌孢子10,6,/,ml,、细菌10,8,/,ml,诱变剂的选择及其剂量的确定,以致死率为,90,99,为宜,诱变处理, 物理诱变剂 化学诱变剂,确定出发菌株,菌种的纯化选优,出发菌株的性能鉴定,同步培养,制备单细胞（或单孢子）悬液,活菌浓度测定,诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验,诱变处理,平板分离,计形态变异的菌落数，计算突变率,挑取疑似突变菌落纯培养,突变体的初步筛选,用简单快捷的方法,重复筛选,摇瓶发酵试验,选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）,二、微生物的诱变育种,23,二、微生物的诱变育种,（二）变异菌株的初步筛选,纸片培养显色法,透明圈法,琼脂块培养法,24,1 筛选用培养基, 基本培养基：凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基；常以,-,表示；, 在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培养基，称为完全培养基，常用,+,表示；, 在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种营养缺陷成分，以满足相应的营养缺陷型生长的培养基，称为补充培养基，补充培养基可按所加入营养成分相应地用,A,、,B,等来表示。,（三）营养缺陷型突变体的筛选及其应用,二、微生物的诱变育种,2,营养缺陷型菌株筛选的一般方法,（,1,）诱变剂处理,（,2,）淘汰野生型菌株, 抗生素法, 菌丝过滤法,（,3,）,检出营养缺陷型,（,4,）鉴定营养缺陷型,25,检出营养缺陷型,夹层培养法, 限量补充培养法, 影印接种法,逐个检出法,26,鉴定营养缺陷型, 含营养缺陷型菌株的基本培养基平板的制备。, 营养缺陷型营养类别的鉴定。, 缺陷型菌株单一营养因素的鉴定。,20,种氨基酸的排列编组,27,原生质体融合育种,细胞（,A,+,B,）,细胞（,A,B,+,）,脱壁处理,脱壁处理,原生质体（,A,+,B,）,原生质体（,A,B,+,）,混合,加融合剂,原生质体融合,涂平板（原生质体再生）,形成菌落,检出重组子菌落（,A,+,B,+,）,28,转基因工程菌株的构建,1,提取目的基因 用密度梯度离心方法分别从供体细胞中提取所需要的,DNA,即目的基因和作为载体的细菌质粒或噬菌体核酸，目的基因也可通过化学方法人工合成。,2,处理目的基因 根据基因工程的“设计蓝图”的要求，在从供体细胞中提取出的目的基因中加入专一性很强的限制性核酸内切酶进行处理，从而获得带有特定基因并暴露出粘性末端的,DNA,单链部分。必要时这种粘性末端也可用人工方法合成。,对作为载体的细菌质粒或噬菌体,DNA,可采用与处理目的基因同一种类的限制性核酸内切酶进行处理，使其形成并暴露出与目的基因相应的粘性末端。,3,体外重组 将上述分别处理过的目的基因和细菌质粒,DNA,片段（或噬菌体核酸）放在试管中，在较低温度（,5,6,）下混合“退火”。由于这两种,DNA,是用同一种限制性核酸内切酶进行处理，具有相同的粘性末端，因此相互之间能够形成氢键，这就是所谓“退火”。而相邻的核苷酸，在,DNA,连接酶的作用下也能形成磷酸二酯键，这样就完成了目的基因与质粒,DNA,（,或噬菌体,DNA,）,的重组，得到的是一个完整的具有复制能力的环状,DNA,重组体，即“杂种质粒”（或杂种噬菌体）。,4,载体传递 即通过载体将供体生物中的遗传基因导入到受体细胞内。载体必须具有自我复制的能力，一般可利用质粒的转化作用或噬菌体的转导作用，将供体基因带入受体细胞内。,5,复制、表达 在理想情况下，进入受体细胞内的杂种质粒（或杂种噬菌体），可通过自我复制到扩增，并使受体细胞表达出作为供体细胞所固有的部分遗传性状，成为“工程菌”。,6,筛选、繁殖 当前，由于分离纯净的基因功能单位还很困难，所以通过重组后的“杂种质粒”的性状是否都符合原定的“设计蓝图”，以及它能否在受体细胞内正常增殖和表达等，都还需要经过仔细检查，以便能在大量个体中设法筛选出所需要性状的个体，然后才可加以繁殖和利用。,29,第五节 微生物菌种的保藏和复壮,一、菌种的保藏,1,低温保藏法 斜面菌种直接放入,0,4,冰箱中保藏，保存时间不宜过长，一般为,3,6,个月； 用,-20,以下的超低温冰箱或干冰、液氮（,-195,）冻结保藏，长达数年。,2,干燥保藏法 主要是指把菌种接种到适当载体上，在干燥条件下进行保藏。这种保藏方法主要适合于细菌的芽胞和霉菌的孢子。细菌芽胞用沙土管保藏；霉菌的孢子多用麸皮管保藏。,3,隔绝空气保藏法 用固体石蜡密封试管口以隔绝空气，,4,真空冷冻干燥保藏法 其基本过程是：培养菌种加菌种保护剂（一般食品工业用菌种多用牛乳作保护剂）分装、预冻真空冻干真空封口。,5,寄主保藏法 用常规方法保藏的动植物病原菌和病毒。,30,第五节 微生物菌种的保藏和复壮,二、菌种的退化与复壮,（一）,常见的菌种退化现象,（二）,菌种退化的原因,菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。,（三）,防止菌种退化的措施,1控制传代次数,2创造良好的培养条件,3利用不同类型的细胞进行移种传代,4采用有效的菌种保藏方法,（四）,退化菌种的复壮,31,