微生物及无菌知识培训、六步洗手法及进入洁净车间程序

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物及无菌知识培训,六步洗手法,进入洁净车间的程序,1,微生物及无菌知识培训,一、前言,我们所生活的环境中，到处都存在着大量的微生物。在一般空气中，微生物达,8003500,个,/m3,，在土壤中达,1500108,个,/g,，在严重污染的水中可达,107,个,/ml,。（饮用水要求细菌总数,100,个,/ml,，大肠杆菌,3,个,/ml,。经水塔或贮水池贮存后，短期内可繁殖至,105106,个,/ml,。）人的头皮上有,140,万个,/cm2,，两手上约有,440,万个，,1g,指甲污垢有,38,亿个，,1g,粪便可达,101000,亿个。可以说微生物是无处不在，无处不有。许多以前被人们认为是极端（高温、高压、强酸、强碱、低温等）甚至是致死的环境，现在已发现生活着各种类型的微生物（称为极端微,2,生物）。事实说明，微生物有特别顽强的生存、繁殖和变异能力来适应环境。微生物种类繁多，有的对人有益，有的有害，有的无益也无害。但在药品生产过程中，不可能对环境中的各种微生物加以区别对待，为保证药品的安全有效，需要对其进行控制。空气中的微生物多数附着在灰尘上，或以芽孢形式悬浮于空气中，,1m,以下者处于悬浮状态，,10m,以上者会逐渐沉下来而形成菌尘。所以也要对尘粒进行控制。大量临床资料表明，注射剂（尤其是静脉注射剂）如污染了,712m,的尘粒，可导致热原反应、肺动脉炎、微血栓或异物肉芽肿等，严重的还会致人死命。而如果污染了细菌，轻则局部红肿化脓，重则引起全身细菌性感,3,染。因此，对微生物和尘粒进行更加严格的控制对于针剂生产洁净室非常重要。人是洁净室最大的污染源，占,90%,左右。一般男性每人每分钟向周围排放,1000,个以上的含菌粒子，女性为,750,个以上。穿无菌服时，静止时的发菌量为,10300,个,/min,，一般活动时发菌量为,1501000,个,/min,，行走时发菌量为,9002500,个,/min,。咳嗽一次发菌量为,70700,个,/min,，喷嚏一次为,400060000,个,/min,。所以在洁净室中，人的数量和活动应有特别严格的限制。二微生物简介,4,微生物是广泛存在于自然界的一群体形微小（直径小于,1mm,）、结构简单、肉眼看不见，必须藉助光学或电子显微镜放大数百至数万倍才能观察到的生物。需要说明的是，微生物是一个比较笼统的概念，界线有时非常模糊。如单细胞藻类和一些原生动物也应算是微生物，但通常它们并不放在微生物中进行研究。微生物具有以下特点：体积小，面积大；吸收多，转化快（,2000,倍体重,/h,）；生长旺，繁殖快（,20min,分裂一次）；易变异，适应强；分布广，种类多（,10,万种以上）。微生物按其结构、化学组成及生活习性等差异可分成三大类：,1,真核细胞型细胞核的分化程度较高，有核膜、核仁和染色体；胞质内有完整的细胞,5,器（如内质网、核糖体及线粒体等）。真菌属于此类型微生物。,2,原核细胞型细胞核分化程度低，仅有原始核质，没有核膜与核仁；细胞器不很完善。这类微生物种类众多，有细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体和放线菌。,3,非细胞型没有典型的细胞结构，亦无产生能量的酶系统，只能在活细胞内生长繁殖。体积微小，能通过除菌滤器。病毒属于此类型微生物。微生物在自然界中的分布极为广泛，空气、土壤、江河、湖泊、海洋等都有数量不等、种类不一的微生物存在。在人类、动物和植物的体表及其与外界相通的腔道中也有多种微生物存在。,6,绝大多数微生物对人类和动、植物的生存是有益而必需的。自然界中氮、碳、硫等多种元素循环靠微生物的代谢活动来进行。例如空气中的大量氮气只有依靠微生物的作用才能被植物吸收，土壤中的微生物能将动、植物蛋白质转化为无机含氮化合物，以供植物生长的需要，而植物又为人类和动物所利用。因此，没有微生物，植物就不能新陈代谢，而人类和动物也将无法生存。另一方面，由极少数微生物引起的传染病发病快、死亡率高、传播迅速、传播范围广，严重危害着人民健康。,三微生物的形态结构,7,1,细菌（原核单细胞生物）细菌按形状可分为：球菌（,0.52m,）、杆菌（长,15m,，宽,0.31m,）和螺形菌（大小与杆菌相似）。按革兰氏染色法染色的不同，分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌的细胞壁表面含较多的磷壁酸，会产生外毒素，如金黄色葡萄球菌；革兰氏阴性菌的细胞壁表面多含脂蛋白和脂多糖，会产生内毒素（即热原），如大肠杆菌。细菌一般有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核，有的还有荚膜、鞭毛、菌毛和芽胞等特殊结构。细菌一般为无性繁殖，以二分法繁殖，几十分钟或,12,小时分裂一次。,8,资料：关于芽孢在温度逐渐降低或营养缺乏时，芽胞杆菌属（如炭疽杆菌）及梭状芽胞杆菌属（如破伤风杆菌）能在菌体内形成一个折光性很强的不易着色小体，称为芽胞。芽胞是处于休眠状态的细菌，并非细菌的繁殖体，当环境适宜时，可恢复生长繁殖。芽胞在自然界分布广泛，要注意防止污染。芽胞的抵抗力强，对热力、干燥、辐射、化学消毒剂等理化因素均有强大的抵抗力，用一般的方法不易将其杀死。有的芽胞可耐,100,沸水煮沸数小时。杀灭芽胞最可靠的方法是高压蒸汽灭菌。当进行消毒灭菌时往往以芽胞是否被杀死作为判断灭菌效果的指标。,2,霉菌（丝状真菌的通称，真核多细胞生物）,9,霉菌是真菌的一部分。在培养基上长成绒毛状或棉絮状的菌丝体的真菌统称为霉菌。霉菌细胞呈狭长的管状，称为菌丝。菌丝直径比细菌、放线菌大，约,210m,。菌丝分枝连接，交错集合在一起的总体称为菌丝体。霉菌大多数是多细胞微生物，菌丝细胞由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核和各种细胞器组成。细胞壁很薄，往往在表面产生色素，使菌落出现各种颜色。霉菌靠孢子繁殖，有无性繁殖和有性繁殖两种方式，以无性繁殖为主。有些真菌可用酿酒造酱，或用于发酵生产柠檬酸、葡萄糖酸、酶、抗生素（如青霉素、头孢菌素）；少数真菌能引起各种真菌病。真菌产生的真菌毒素（如黄曲霉素）有毒。,10,3,酵母菌（真核单细胞生物，属真菌）酵母菌以单细胞存在，呈圆形、卵圆形和香肠形，比细菌大，细胞长,530m,，宽,15m,。细胞结构有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核和各种细胞器等。酵母菌的增殖分无性繁殖和有性繁殖两个阶段，有三种方式：芽殖、裂殖、孢子生殖。酵母菌是重要的工业微生物，用于酿酒，生产单细胞蛋白、,B,族维生素、核酸、辅酶,A,、细胞色素,C,等。一般对人体无害。,4,放线菌（原核单细胞生物）放线菌有生长发育良好的菌丝体，呈分枝状，菌丝宽为,0.21.2m,，革兰氏阳性。其内部构造与细菌相似，无完整的细胞核。菌落常呈幅射状，因此称放线菌。,11,繁殖方式为无性孢子繁殖。最适,pH6.77.5,，温度,2530,。放线菌可用于生产抗生素、维生素和酶类，少数可引起人畜放线菌病。,5,病毒病毒是一类体积十分微小，结构简单，只含一种核酸（,DNA,或,RNA,），没有产生能量的酶系统，只能在活细胞内以复制方式增殖的非细胞型微生物。病毒在自然界分布非常广泛，在所有其它生物中都有病毒寄居。病毒是最常见的致病微生物，人类传染病中大约,75%,是由病毒引起的。病毒体主要由核酸和蛋白质组成。病毒体积微小，最大直径,300nm,（如牛痘病毒），最小直径,20nm,（如口蹄疫病毒），绝大多数在,12,150nm,以下，能通过细菌滤器，用普通光学显微镜看不见，必须用电子显微镜放大数千至数万倍才能看见。形态多呈球形，少数为杆状或砖形。噬菌体（细菌病毒）有呈蝌蚪状的。朊病毒于,1982,年发现，它很特殊，与一般病毒不同，是一种异常蛋白质，不含有核酸。与疯牛病（牛海绵状脑病）及人克雅氏病关系密切。其复制方式不明。,四微生物的营养,1,水分：水占细胞浆的,70%,90%,，是细胞的重要组成成分。较普遍的观点认为：只有,13,在含水的环境中微生物才能存活。但也有人发现在无水碳氢化合物中微生物可长期存活。,2,碳源：碳源是构成细胞的重要物质。有些微生物的碳源必须来自有机碳化合物如糖、蛋白质、脂肪、有机酸等（同时利用其化学能），属异养型；有些微生物不需有机碳化合物，以,CO2,为碳源，属自养型（分为光能自养型和化能自养型）。,3,氮源：氮是组成蛋白质和核酸的重要元素。,4,无机盐类：细菌所需无机盐包括磷、硫、镁、铁、钾、钠、钙、氯、锰、锌、钴、铜等。其中磷、硫、镁、钾、钠、铁需要量较多，其他只需微量。,5,生长因子：生长因子是某些微生物生长发,14,育所必需，而其自身又不能合成的一类营养物质。包括维生素、嘌呤和嘧啶等。,五微生物生长的影响因素,1,营养物,2,pH,值：各种微生物都有其最适宜的,pH,值，大多数细菌最适,pH,为,6.87.4,，但一般有较大的容忍度，在,49,也可存活和生长，少数细菌能在极端,pH,值范围内生长。真菌适于,pH,值,36,的微酸性环境，但在,210,也可生长。,3,温度：微生物适于生长繁殖要有适宜的温度，当超过其最低或最高可耐受的温度时，即停止生长或死亡。一般细菌最适温度为,15,3040,，真菌为,2030,。,4,氧气：大多数细菌和所有霉菌都是需氧菌（在有氧环境中才能生长），少数细菌是厌氧菌（在无氧环境中才能生长），有些细菌和酵母菌是兼性需氧厌氧的，在有氧或无氧环境中都能生长繁殖。,5,渗透压：微生物细胞膜和所有生物膜一样是一种半透膜，可让水自由通过，对溶质则有选择性。由于细胞壁的保护，微生物能存活在低渗透压的水中。而在高渗溶液（如高浓度的盐溶液或糖溶液、,40%,甘油）中，细胞会脱水并停止生长繁殖。但也有一些专性耐高盐细菌只有在高盐（,1015%,）条件下才生长。,6,表面张力：表面活性剂可降低表面张力,16,它是影响细菌生长的因素之一。很多革兰氏阴性菌，特别是大肠菌群可很好地在表面活性剂包围的介质中生长，而大多数革兰氏阳性菌在表面张力低时（,0.05N/m,）不能很好生长。阳离子表面活性剂对很多有机体有毒性，阴离子表面活性剂毒性很小，非离子表面活性剂几乎没有毒性，并可成为某些微生物的营养物。,六消毒与灭菌,消毒与灭菌是微生物实验技术中最基本的操作，从事药品生产和检验的人员都应当了解消毒与灭菌的方法及其意义，严格遵守操作规程，否则会影响产品质量，危害患者安全。,1,概念,17,1,概念无菌,不存在活的生物（,GMP,指南）。,“,无菌,”,从定义上来说是一个绝对的概念，但遗憾的是，在科学和技术高度发展的今天，药品的绝对无菌即做不到，也无法加以证实。然而，无菌制剂的安全性要求人们设定无菌的相对标准。,FDA,、欧洲制药工业界曾将百万分之一微生物污染率作为灭菌产品,“,无菌,”,的相对标准，它和蒸汽灭菌后产品中微生物存活的概率为,10-6,（即产品的无菌保证值为,6,），系同一标准的不同表示法。这一标准于,1980,起收录于,USP XX,中，如今已为世界各国普遍接受和采用。灭菌,使达到无菌状态的方法（,GMP,指南,18,南）。用物理或化学方法杀灭传播媒介上所有的微生物，使其达到无菌（,GB,）。通常是指杀灭或除去全部活的微生物（包括繁殖体和芽孢）。,消毒,用物理或化学方法杀灭或清除传播媒介上的病原微生物，使其达到无害化（,GB,）。通常是指杀死病原微生物的繁殖体，但不能破坏其芽孢。所以消毒是不彻底的，不能代替灭菌。,无菌制剂,不存在活的微生物的制剂（,GMP,指南）。,非无菌制剂,所含活的微生物量符合卫生学标准的制剂（,GMP,指南）。,2,常用消毒剂消毒剂,常用量,用途,19,乙醇,70%75%,水溶液,0.5%,洗必泰溶于,70%,乙醇，再加入,2%,甘油,用于皮肤、器具等消毒供洗手用消毒异丙醇,75%,水溶液,用于皮肤、器具等消毒甲醛,37%40%,甲醛液,89ml,，再加入,45g,高锰酸钾,每,m3,熏蒸量，密闭,1224h,。刺激性强戊二醛,2%,水溶液,用于空气、器具等消毒。广谱、高效、低毒，可杀芽孢和病毒。刺激性较轻。新洁尔灭（苯扎溴铵）,0.1%,水溶液,用于皮肤、粘膜、器具等消毒，有清洁和消毒双重功效。抗菌谱较窄。,20,杜灭芬（消毒宁）,0.05%0.1%,水溶液,用于皮肤、器具等消毒过氧乙酸,0.2%0.5%,水溶液 新配,0.5%,水溶液,1g/m3,用于器具等消毒抗菌谱广，可用于皮肤消毒杀灭某些病毒熏蒸但性质不稳定乳酸,0.331mol/L 11.5ml/m3,熏蒸或与等量苯酚合用熏蒸,喷雾，用于空气消毒，有强杀菌作用熏蒸，密闭,12h,以上麝香草酚,5%,麝香草酚溶于,50%,乙醇,喷洒墙面、地面，杀霉菌,21,3,常用灭菌法,1,）干热灭菌法常见的有火焰、烧灼、干烤和红外线灭菌等。火焰、烧灼：通常用于实验室无菌操作中金属或其它耐火材料制成的器具的灭菌。干烤和红外线：利用干热空气或热辐射进行灭菌。一般,135145,需,35h,，,160170,需,2h,以上，,170180,需,1h,以上，,180200,需,0.51h,。除热原则需,25030min,，或,20045min,，,1802h,。空气传热慢，穿透力不强，故干热灭菌时间长。干热灭菌时烤箱内装入物品应留有空隙，以利空气流动，否则使箱内温度不均，部分物品灭菌不彻底。,22,2,）湿热灭菌法通过热蒸汽或沸水使蛋白质变性而杀灭微生物的方法。湿热穿透力强，灭菌效果较干热好。煮沸或流通蒸汽灭菌：常压下沸水和蒸汽的温度是,100,，一般处理,3060min,可杀死细菌繁殖体，但不能完全杀灭芽孢。此法适用于不能高压蒸汽灭菌的物品。低温间隙灭菌（巴斯德灭菌法）：将物品先用,6080,加热（或煮沸）,1h,，然后置,2025,保存,24h,（或常温过夜），使其中残存的芽孢萌发成繁殖体，再用以上条件灭菌，如此反复三次。本法适用于不耐高温或高温下易变质的物品，但很费时。高压蒸汽灭菌（热压灭菌法）：超过一个大气压时，水的沸点高于,100,，反之亦然。,23,高压蒸汽灭菌就是通过加压提高蒸汽温度，灭菌效果最好。它简便、经济、可靠、无毒，是最可靠、应用最广泛的灭菌法。此法适用于耐高温和潮湿的物品。常用条件为：,115.5,30min121.5,20min126.5,15min,注意事项：,a.,必须完全排出灭菌器内的空气。否则会影响灭菌器内温度达到规定的要求。,b.,注意被灭菌物品的温度。灭菌器内温度与被灭菌物品的温度一般是一致的，但在蒸汽输入过快时，后者可能低于前者，所以升温时要有一定的预热时间。另外，降温过快易引起玻璃炸裂。因此，对于一种灭菌产品，,24,应制定一固定的灭菌曲线（象冻干曲线一样）。,c.,定期检查灭菌器内温度的准确性。,3,）化学灭菌法利用化学试剂形成的气体来杀灭微生物的方法。常用的灭菌剂为环氧乙烷（又称氧化乙烯）。环氧乙烷是广谱杀菌剂，能杀灭细菌、芽孢和多种病毒，还能杀死昆虫及虫卵。但由于环氧乙烷易燃易爆且有毒（有致变异性），用于药品方面极有限，多用于医疗器械、塑料制品等灭菌。（不能用于橡胶和乳胶手套，能将其溶解。）,4,）滤过除菌法利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理，除去对热不稳定的药品溶液或液体物质中的细菌的方法。过滤法一般只能除菌，不能除去支原体和病毒。,25,过滤除菌的效果与滤膜的性能、孔径的大小、密度、滤膜的厚度等因素有关。滤过除菌法要求最终过滤的滤膜孔径为,0.22m,。由于各厂家生产的相同规格的滤膜质量并不一致，为了保证除菌效果，在使用前后应检查滤器的完好性（如压力维持试验或起泡点试验）。一个过滤器的使用时间应根据品种验证后确定，一般不应超过,8,小时。,5,）辐射灭菌法辐射有两种类型：一种是电磁波辐射，如紫外线、红外线、微波；一种是电离辐射，如可引起被照射物电离的,X,射线、,射线。紫外线：紫外光波长在,136390nm,之间，其中,260nm,左右能破坏核酸，杀菌作用最强。,26,另外，空气中的氧受紫外线照射后，可微量转变为臭氧共同起杀菌作用。紫外线消毒的效果与光源的功率、光源与被照射物的距离、照射时间、温度和湿度等因素有关。我国规定紫外灯照射强度在距离,1m,处不低于,70W/cm2,（以紫外线测强仪测定）。在操作面上要求强度达,40W/cm2,以上。一般每,10m2,装,30W,灯管,1,支，工作前开,3060min,。紫外灯的输出功率随使用时间增加而降低。国产紫外灯的平均寿命（点到,70%,额定功率的时间）一般为,2000h,，超过平均寿命时，就达不到预期效果，必须更换。紫外线的穿透力很弱，不能穿透一般包装材料，如玻璃、塑料薄膜、纸等。玻璃能强烈吸收小于,350nm,的紫外线，石英玻璃能吸收,27,小于,200nm,的紫外线。因此，它主要用于空气和物体表面消毒，特制的紫外灯装置也可用于水的消毒。紫外线对眼、皮肤有损坏，照射过程中产生的臭氧对眼、鼻腔有刺激，臭氧过多时使人头晕、胸闷、血压下降。红外线：通过加热碳化硅板产生的辐射热能，由空气传导加热灭菌。如红外线烤箱，温度可达,180,左右。热效应特点是由表及里。微波：微波灭菌主要是因其热效应。微波加热升温快，温度高且均匀，杀菌作用强。热效应特点是由里及表。不同性质的物品吸收微波的能力不同，其热效应和消毒效果也不同。,28,微波有一定穿透力，但不强。微波对人体有害，要注意防护。,60Co,灭菌：放射性同位素,60Co,（或,137Cs,）衰变时可放射出,射线，,射线的能量高、穿透力强，可使细胞内各种活性物质发生化学变化，从而使细菌损伤或死亡。经,60Co,辐射灭菌的物品温度升高很少，一般仅约,5,，故又称,“,冷灭菌,”,。,60Co,辐射存在两个方面的安全问题：一是辐射的直接作用。,射线对人体细胞同样有害；二是经过辐射的食品、药品的安全性。,1984,年美国农业部食品安全实验室用辐射处理的鸡肉喂饲小鼠，发现患*肿瘤增加，包括加重癌病损害。因此,60Co,辐射用于食品和药品都应经过安全试验，进行科学的、全面的评,29,价，高剂量的辐射药品更应慎重。美国药典（？版）规定,25kGy,为有效灭菌剂量。,1997,年我国卫生部颁发了,60Co,中药灭菌标准，该标准限国内流通中药可用,60Co,辐照灭菌，规定了允许辐照的药材和中成药的品种和剂量。中药辐照最大吸收剂量标准：散剂,3kGy,片剂,3kGy,丸剂,5kGy,中药原料粉,6kGy,附录：,1,药品生产洁净室（区）的空气洁净度等级（,GMP1998,）洁净度级别,尘粒最大允许数（个,/m3,）,微生物最大允许数,0.5m,5m,浮游菌（个,/m3,）,沉降菌（个,/,皿）,100,级,3,500,0,5,110,000,级,350,000,2,000,100,3,30,100,000,级,3,500,000,20,000,500,10300,000,级,10,500,000,60,000,15,注：我国,GMP1998,附录规定：,“,洁净室（区）在静态条件下检测的尘埃粒子数、浮游菌数或沉降菌必须符合规定，应定期监控动态条件下的洁净状况。,”,因此，洁净室（区）空气洁净度的测定要求为静态测试，动态监控。对尘粒和微生物中的两项测定指标，至少各测一项。空气洁净度为,100,级的洁净室，室内大于等于,5m,尘粒的计数，应进行多次采样，当某一测试值多次出现时，该值方可认可。测试按,医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法,。,2,水和一些物料的卫生学（法定）标准：,饮用水,某些辅料,#,二部片剂,二部胶囊剂,%,XX,霜*细菌总数,100/ml,1000/g,1000/g,1000/g,100/g,霉菌、酵母菌数,100/g,100/g,100/g,10/g,大肠杆菌,3/100ml,NC,沙门氏菌,NC,NC,NC,NC,铜绿假单胞菌,NC,NC,NC,金黄色葡萄球菌,NC,NC,NC,注：,#,：包括有乳糖、药用炭、淀粉、葡萄糖、糊精。,31,%,：,XX,胶囊属中药制剂，含胎盘粉，按中国药典,2000,版一部规定，还不得检出沙门菌。*：,XX,霜属中药制剂，用于创伤、烧伤，故要求细菌总数,100,个,/g,、霉菌数,10,个,/g,。说明：表示每,1g,或每,1ml,不得检出。,NC,：表示无规定。可不检查。,32,六步洗手法,33,六步洗手法,科学的六步洗手法是在平时日常生活中预防肠道传染病的关键。现做以下介绍：,第一步：,掌心相对，手指并拢相互摩擦；,第二步：,手心对手背沿指缝相互搓擦，交 换进行；,第三步：,掌心相对，双手交叉沿指缝相互摩擦；,34,第四步：,一手握另一手大拇指旋转搓擦，交换进行；,第五步：,弯曲各手指关节，在另一手掌心旋转搓擦，交换进行；,第六步：,搓洗手腕，交换进行。,最好流水洗手加肥皂擦洗，,90%,左右的沾污在手上的微生物都能洗干净。如果几个人合用一盆水，在某种,35,意义上讲比不洗还不好。 把握洗手时间。手随时随地都有弄脏的可能，时时不停洗手，难以办到。安排是：工作（学习）结束洗一洗手；外出归来洗一洗手；食前便后洗一洗手；特别是食前便后更是不能勿视的一招。 随着生活水平的提高，人们自我保护意识增强，在做好饮食、饮水卫生的同时，注意一双手的卫生，那么，肠道传染病是完全可能预防的。,36,操作员工进入生产区的,清洗、消毒规程,37,操作员工进入生产区的清洗、消毒规程,脱鞋,将鞋放入鞋柜,转身,穿脱鞋,38,将衣服饰物放入衣柜,关柜门,戴口罩,穿洁净衣（下身）,39,穿洁净衣（右袖,）,穿洁净衣（左袖）,穿洁净衣（系帽带）,穿洁净衣（拉拉链）,40,脱拖鞋,转身,穿工鞋,对镜整理,41,清洗,取洗手液,用洗手液揉搓手部,冲洗去除洗手液,42,风淋（面朝西）,风淋（面朝南）,风淋（面朝东）,出风淋室并关门,43,Thank You!,44,