士研究课－现代分子生物学－PCR常见问

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR,常见问题、原因分析及其对策,1,PCR,技术简介,PCR,常见问题、原因分析及其解决方案,提高,PCR,反应特异性的策略,主讲内容,PCR,技术简介,2,PCR,标准反应体系,DNA,模板,引物,反应缓冲液,dNTP,ddH,2,O,耐热聚合酶,3,反应体系对,PCR,扩增的影响,DNA,模板,纯度,蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制,PCR,反应,完整性,模板降解会导致,PCR,扩增无产物,浓度,加量过多导致非特异性扩增增加,特异性,长度适当,、,避免二级结构和二聚体,完整性,避免反复冻融,浓度,应适当,过高导致非特异性增加,过低则,引 物,扩增产物太少,4,反应体系对,PCR,扩增的影响,反应,Buffer,pH,值,盐离子浓度,稳定剂,增强剂,Mg,2,浓度,过高非特异性严重,过低无扩增产物,dNTP Mixture,浓度适当,避免反复冻融,ddH2O,pH,值适当,避免污染,5,PCR,标准反应体系,DNA,模板,引物,反应缓冲液,Mg,2,dNTP,ddH,2,O,耐热聚合酶,6,如何选择,最合适,的,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶的特性,PCR,实验的不同需求,7,如何选择,最合适,的,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶的特性,纯 度,稳定性,酶活性,8,如何选择,最合适,的,DNA,聚合酶,PCR,实验的不同需求,长片段扩增,PCR,试剂盒,扩增效率,保 真 性,特 异 性,基因组扩增,、,RT-PCR,基因筛选,、,测序,、,基因克隆,复杂模板扩增,（,GC,含量高,、,二级结构,）,构建基因图谱,、,测序,、,分子遗传学,复杂模板扩增,、,大规模基因检测,9,特异性, 热启动,Taq,酶,原 理,蜡封,抗体抑制,化学修饰,特 点,避免非特异性扩增,提高,PCR,反应的,特异性,用 途,基因组扩增,RT-PCR,10, 热启动,Taq,酶,特异性,产 品 类 型,产 品 名 称,产 品 性 能,化学修饰,天为时代,: HotStart Taq,Roche : FastStart Taq,Abgene: Thermo-start,DNA Polymerase,Stratagene: SureStart Taq,大大提高,PCR,反应的特异性,化学修饰不影响后续实验,抗体抑制,Invitrogen,：,AccuPrime,TM,Taq,Platinum,Taq,TaKaRa,：,ExTaq,TM,HotStart,Version,蜡封,Promega,：,TaqBead,TM,HotStart,11,保真性,高保真酶,原 理,用 途,3,5,核酸,表达基因的克隆,基因的定点突变,细胞内基因点突变分析,（,SNP,）,外切酶活性,降低碱基错配率,12,保真性,高保真酶,产 品 类 型,生 物 公 司,性 能 比 较,Pfu,DNA Polymerase,天为时代,Stratagene,Promega,在目前已发现的所有耐热聚合酶中, Pfu,保真度最高碱基错配率最低,Pyrobest,TM,DNA Polymerase,TaKaRa,Tli,DNA Polymerase,Promega,13,高保真,高扩增效率,原 理,混合酶,高扩增效率,3,5,核酸外切,用 途,超长片段扩增,测序,构建基因图谱,复杂模板扩增,GC,含量高,二级结构,14,高保真,高扩增效率,特 点,产 品,性 能,高扩增效率,天为时代,：,Taq Plus,TaKaRa,：,Ex Taq,TM,复杂模板扩增,高保真,天为时代,：,Taq Platinum,Invitrogen,：,Pfx,Platinum,Taq High Fidelity,保真度低于,Pfu,聚合酶,但扩增效率较高,长片段扩增,天为时代,：,Long Taq,TaKaRa,：,LA Taq,Invitrogen,：,Elongase,Amplificaiton System,特别适用于保真度较高的 超长片段扩增,15,PCR,MasterMix,原 理,预配好的,PCR,反应液,DNA,聚合酶,反应缓冲液,dNTP,PCR,增强剂,16,PCR,Master Mix,特 点,快速简便,减少加样误差和污染,灵敏度高,可扩增低至,2,个拷贝的目的模板,特异性强,降低,PCR,反应的要求，,增强特异性,稳定性好,长期放置活性无改变,适用范围,大规模基因检测,目的基因拷贝数极低的样本,GC,含量高,有二级结构的模板,复杂基因组样本,可直接检测菌落，基因点突变检测,或者阳性克隆的筛选。,17,PCR,技术简介,PCR,常见问题、原因分析及其解决方案,提高,PCR,反应特异性的策略,PCR,常见问题、原因分析及其解决方案,18,PCR,常见问题,无扩增产物,非特异性扩增,拖尾,假阳性,19,PCR,常见问题之一,无扩增产物,模板,:,含有抑制物，含量低,Buffer,对样品不合适,引物设计不当或者发生降解,反应条件：,退火温度太高，延伸时间太短,原因,对,策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板,DNA,或加大模板的用量,更换,Buffer,或调整浓度,重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物,降低退火温度、延长延伸时间,现象：,正对照有条带，而样品则无,；,20,PCR,常见问题之二,非特异性扩增,现象：,PCR,扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,21,PCR,常见问题之二,引物特异性差,模板或引物浓度过高,酶量过多,Mg,2+,浓度偏高,退火温度偏低,循环次数过多,原因,对,策,重新设计引物或者使用巢式,PCR,适当降低模板或引物浓度,适当减少酶量,降低镁离子浓度,适当提高退火温度或使用二阶段温度法,减少循环次数,非特异性扩增,22,PCR,常见问题之三,拖尾,现象：,产物在凝胶上呈,Smear,状态,。,M 1 2,23,PCR,常见问题之三,模板不纯,Buffer,不合适,退火温度偏低,酶量过多,dNTP,、,Mg,2+,浓度偏高,循环次数过多,原因,对,策,纯化模板,更换,Buffer,适当提高退火温度,适量用酶,适当降低,dNTP,和,镁离子,的浓度,减少循环次数,拖尾,24,PCR,常见问题之四,假阳性,（筛选转基因、检测基因表达情况,),原因：,靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：,空白对照出现目的扩增产物,对策：,操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；,除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。,各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,25,PCR,技术简介,PCR,常见问题、原因分析及其解决方案,提高,PCR,反应特异性的策略,提高,PCR,反应特异性的策略,26,巢式,PCR,（,Nest-PCR,）,四种策略,递减,PCR,（,TouchDown PCR,）,热启动,PCR,（,HotStart PCR,）,使用,PCR,增强剂,27,策略之一,巢式,PCR,（,Nest-PCR,）,P,1,P,2,P,3,P,4,巢式,PCR,的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。,巢式,PCR,可以增加有限量靶序列,（,如稀有,mRNA,）,的灵敏度，并且提高了困难,PCR,（,如,5 RACE,）的特异性。,28,策略之二,递减,PCR,（,TouchDown PCR,）,递减,PCR,通过在,PCR,的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的,Tm,高大约,5,的退火温度下开始，然后每个循环降低,1,-,2,直到退火温度低于,Tm,5,。,特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。,递减,PCR,对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如,AFLP,、,DNA,指纹分析等。,29,策略之三,热启动,PCR,（,HotStart PCR,）,热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟,DNA,合成，直到,PCR,仪达到变性温度；,现在有很多公司都有,HotStart Taq,酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用,；,热启动,PCR,是除了好的引物设计之外，提高,PCR,特异性最重要的方法之一。,30,策略之四,使用,PCR,增强剂,甲酰胺，,DMSO,，甘油，甜菜碱等都可充当,PCR,的增强剂。,其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助,DNA,聚合酶延伸通过二级结构区,。,增强剂浓度要适当,31,谢谢！,32,