固液分离和细胞破碎讲述案例

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,固液分离和细胞破碎讲述案例,目的,不仅在于分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物），,还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后继各步操作。,采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速度；,或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。,第一节 发酵液的预处理,一、发酵液过滤特性的改变,培养液的组成：,水70-80%,+,固体细胞及碎片20-30%(对微生物发酵)+,少量的代谢成物 +,细胞破裂后的内容物 +,残存的培养基成分,微生物发酵液的特性为：,发酵产物浓度较低，大多为1-10%，悬浮液中大部分是水；,悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；,固体粒子可压缩性大；,液相粘度大，大多为非牛顿型流体；,性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。,预处理的目的,（1）改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率；,（2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数为液相）；,（3）除去发酵液中的部分杂质，以利于后续各步操作。,发酵液预处理的方法：,加热法,调整,pH,凝聚与絮凝,使用惰性助滤剂,加入反应剂,最简单和价廉的预处理方法，即将悬浮液加热到所需温度并保温适当时间。,可有效降低悬浮液的黏度，并加速聚集作用以去除某些杂蛋白；降低悬浮液的最终体积，,pH,pH,值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节,pH,值可改善其过滤特性。在膜过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整,pH,值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染；细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个,pH,值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。,3.,凝聚与絮凝,采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。,凝聚,指在投加的化学物质（如铝、铁的盐类或石灰等）作用下，胶体 脱稳并使粒子相互聚集成1,mm,大小块状凝聚体的过程。,絮凝,指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶体颗粒交联成网，形成10,mm,大小絮凝团的过程。,（1）凝聚,发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。,阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：,Al,3+,Fe,3+,H,+,Ca,2+,Mg,2+,K,+,Na,+,Li,+,常用的凝聚剂电解质有：,硫酸铝,Al,2,(SO,4,),3,18H,2,O(,明矾),氯化铝,AlCl,3,6H,2,O,三氯化铁,FeCl,3,硫酸亚铁,FeSO,4,7H,2,O,石灰；,ZnSO,4,；MgCO,3,（2）絮凝,絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物,，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如-,COOH）,或阳离子（如-,NH,2,）,基团以及不带电荷的非离子型基团。,它们通过,静电引力、范德华引力或氢键,的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。,当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。,1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；,2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；,3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。,目前最常见的高分子聚合物絮凝剂：,有机合成的聚丙烯酰胺（,polyacrylamide）,类衍生物,根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：,非离子型、,阴离子型（含有羧基）,阳离子型（含有胺基）,工业上使用的絮凝剂可分为三类：,聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点,用量少，一般以,mg/L,计量；,絮凝体粗大，分离效果好；,絮凝速度快；,种类多，适用范围广。,聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点,存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。,对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理；,对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。,（3）混凝,一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。,常用的助滤剂有： 硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。,使用硅藻土时，通常细粒用量为500,g/m,3,；,中等粒度用量为700,g/m,3,；,粗粒用量为700-1000,g/m,3,。,5.加入反应剂,加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如,CaSO,4,，AlPO,4,等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改善过滤性能。,如发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率；,如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30,min,后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。,发酵液中的杂质,高价无机离子（,Ca,2+,、Mg,2+,、Fe,3+,）,杂蛋白,在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，,在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。,在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。,在预处理时，应尽量除去这些物质。,二、发酵液的相对纯化,(一) 高价无机离子的去除方法,Ca,2+,草酸、草酸钠，形成草酸钙沉淀,（注意回收草酸）,；,Mg,2+,三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；,Fe,3+,黄血盐,(,亚铁氰化钾,)，普鲁士兰沉淀,(二) 杂蛋白的去除方法,蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。,在酸性溶液中带正电荷；,在碱性溶液中带负电荷。,在某一,pH,下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。,1. 沉淀法,1) 酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。,在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；,在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如,Ag,+,、Cu,2+,、Zn,2+,、Fe,3+,和,Pb,2+,等形成沉淀。,2. 变性法,加热，,大幅度调节,pH,值，,加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。,不足之处,加热法只适合于对热较稳定的目的产物；,极端,pH,值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；,有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。,加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。,例如：,在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；,在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。,3. 吸附法,第二节 固液分离工程及设备,重力沉降,浮选,旋液分离,介质过滤,离心,通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。,用于固液比重差小、直径530,m,颗粒的分离，污水处理,悬浮液以较高速度沿切线方向进入,旋风分离器,，,轻相由分离器中央排出，,重相由分离器下部排出，,但不适合直径5,m,颗粒去除（可用丝网分离器）。,工业上常用,霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用过滤方法；,细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采用高速离心分离，如对发酵液进行预处理，也可用过滤进行固液分离。,一、固液分离的方法,1. 离心分离,在液相非均一系统中，利用离心力达到液-液、液-固、液-液-固分离的方法，统称为离心分离。,优点,：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好；,缺点,：设备投资高、能耗大。,离心机种类,：碟片式离心机、管式离心机、倾析式离心机。,离心分离因数,f=,Gu,2,gR,G,gR,(2,Rn),2,60,GRn,2,900,=,=,=,GDn,2,1800,重量,kg,旋转直径,转速,r/min,离心分离因数：又称为离心力强度，表示在离心机中产生的离心加速度与自由下降的加速度之比。,微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。,过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。,在过滤操作中，要求滤速快、滤液澄清，并且有高的收率。,2. 过滤,A.,根据过滤机理和操作可分为澄清过滤和滤饼过滤,澄清过滤：,g/100ml、,颗粒直径在5-100,um,的悬浮液的过滤分离，如河水、麦芽汁、酒类和饮料等的澄清。,滤饼过滤：,g/100ml,的悬浮液的过滤分离。,B.,常用过滤设备,(1) 板框压滤机,广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。,优点:,过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，,对不同过滤特性的发酵液适应性强。,缺点:,不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。,单元组成,板,布,板,布,板,操作注意点,尽量使工作时间和辅助时间接近；,降低滤液粘度,(2) 真空转鼓过滤机,1）切向流过滤,又称错流过滤,交叉过滤和十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走。,2）双水相萃取,向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形成密度不同的两相，轻相中富含某种高分子化合物，重相中富含盐类或另一种高分子化合物，从而达到分离和提纯某种高分子化合物的目的。,3）吸附法,向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂，或者用细胞碎片悬浮液通过装有吸附剂的固定床，即可达到除去细胞碎片的目的。主要的问题是很难选择合适的吸附剂，以保证目的产物不被吸附而损失。,3. 其他固液分离方法,第三节 细胞破碎方法,破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分数。,N,0,：,原细胞数，,N：,破碎后残存的正常细胞。,N,0,和,N,的可通过直接计数和间接计数法得到。,3.2细胞破碎理论,1)、细胞破碎,A,压撞,B,剪切,Ca,渗透,Cb,冻胀,D,破壁破膜,超声波法,高压匀浆机,组织捣碎机,细菌磨,珠磨法,反复冻融法,渗透压冲击法,冷热变替法,有机溶媒法,自溶法,酶法,机械破碎法,物理破碎法,化学破碎法,细胞破碎法,3.3细胞破碎方法,超声波破碎,超声波破碎原理,：超声波作用下液体发生,空穴化作用,，产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。,超声空化：,存在于液体中的微小气泡（空化核）在超声场的作用下振动、生长并不断聚集声场能量，当能量达到某个阈值时，空化气泡急剧崩溃闭合的过程。,优点：,适合于多种细胞的破碎,缺点：,A、,影响因素多，如振幅、黏度、表面张力、液体体积和流速、探头材料和形状；,B、,超声产生超氧离子毒害作用；,C、,有效能量的利用率低；,D、,产热大，需控温；,E、,不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。,高压匀浆破碎原理,：主要利用细胞悬液在高压作用下,液相剪切力,以及,细胞与固定表面的撞击力,而使之破碎。,特点：适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，不宜用于团状或丝状菌的破碎；由于操作中温度会 升高，需对料液作冷却处理，保护目的产物活性。,适合于工业上的大规模应用,高压匀浆破碎,珠磨法破碎原理,：利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相互,磨擦碰撞,而破碎。,珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.,特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低，设计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力； 影响破碎率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。,珠磨法破碎,操作：细胞喷雾高速冻结,300,m/s,氮气流,优点：,A、,细胞破碎仅发生在撞击的一瞬间，破碎程度均匀，避免反复和过度破碎；,B、,破碎的程度可无级调节，避免细胞内部结构的破坏，特别适合于细胞器的回收；,C、,实验室和工业规模均可应用，细胞浓度在10-20%，实验室规模的间歇处理能力在50-500,mL/h，,工业规模的连续处理在 10,000,mL/h,以上。,撞击,法破碎,反复冻融法,于将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。,冷热变替法,将材料投入沸水中，于90左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。,渗透压冲击法,细胞在,高渗透压介质,中平衡后，再突然将其转至,低渗透压,环境中，水会大量进入细胞，使细胞壁和膜胀破。,（2）物理破碎法,（3）化学破碎又称化学渗透,：其原理是利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜结构，增大胞内物质的溶出速率；或者完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。,优点：,A、,产品释放的选择性；,B、,提取速度和收效高；,C、,产品的破坏小；,D、,对外界环境，如,pH,和温度等要求低；,E、,不残留细胞碎片。,粉碎后的新鲜材料在0以下加入510 倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。,有机溶媒法,将待破碎的鲜材料在一定,pH,和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。,自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。,自体融解过程中,pH,显著变化，随时要调节,pH。,自溶温度选在04，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。,自溶法,能溶解菌的酶分布很广。尤其卵白中含量高，而多易结晶化。1,g,菌体加110,mg,溶菌酶，,pH6.27.0 1h,内完全溶菌。,除溶菌酶外，蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。,酶 法,溶菌酶对革兰氏阳性细菌的破碎效果最好,蛋白酶和葡萄糖酶对酵母菌的破碎效果好,一、细胞壁的组成和结构,细菌类,结构,多层三维网状结构,革兰氏阳性和阴性细菌肽聚糖结构图,G,+,G,-,2、霉菌类,组成,几丁质（,N-,乙酰葡聚糖胺的聚合物）、葡聚糖、蛋白质、脂类等,结构,四层三维网状结构,3、酵母菌类,组成,甘露聚醇、葡聚糖、蛋白质、脂类等,结构,三层三维网状结构,3.4物理法和化学法的比较,物理破碎法缺点：,A、,高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活；,B、,非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难；,C、,细胞碎片大小不一，难分离。,化学破碎法缺点：,A、,费用高；,B、,引起新的污染，尤其是其他化学方法；,C、,一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。,3.5破碎方法的选择,选择的一般原则,A、,提取产物在细胞质内，用机械法破碎,B、,提取产物在细胞膜附近，用化学法,C、,提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法,破碎技术杂交研究应注意的问题,A、,杂交技术可产生很大优势。,B、,破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除，产物的分离纯化,C、,在发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的影响,D、,菌种的培育，胞内产物,胞外产物,3.6 细胞器的分离,细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。,如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。,细胞器的分离一般采用,差速离心法,，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。,作 业,1. 名词解释,凝聚；絮凝；破碎率；离心分离因数。,2. 简述发酵液预处理的目的和处理方法。,3. 细胞破碎的方法有哪些？,人有了知识，就会具备各种分析能力，,明辨是非的能力。,所以我们要勤恳读书，广泛阅读，,古人说“书中自有黄金屋。,”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，,培养逻辑思维能力；,通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，,培养文学情趣；,通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。,有许多书籍还能培养我们的道德情操，,给我们巨大的精神力量，,鼓舞我们前进,。,谢谢观赏,