第五章--减压柱色谱分离技术要点课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 减压柱色谱 分离技术,为加快柱分离的速度和/或增加分离度，通常采用在柱前加压和柱后减压的方法进行柱层析与分离,。,柱前加压法通常称为,加压柱色谱,柱后减压法通常称为,减压柱色谱,第五章 减压柱色谱 分,1,第一节 真空液相色谱技术,Vacuum Liquid Chromatography,第二节 半干柱液相色谱,Semi-Dry Column Chromatography SDC,第一节 真空液相色谱技术,2,第一节 真空液相色谱技术,Vacuum Liquid Chromatography,真空液相色谱法,，,简称,VLC,，,也称减压液相色谱法。,是近几年来国外实验室迅速发展起来的新技术，它是利用柱后减压使洗脱剂迅速通过固定相从而很好的分离样品的色谱技术。,VLC,具有快速，简易，高效，价廉等优点，目前已成功的应用于有机制备以及天然产物如萜类，类酯，双萜及多种生物样品的分离,。,第一节 真空液相色谱技术Vacuum Liquid C,3,由于经典的柱层析费时费力，需要大量的固定相和洗脱液，工作效率低，为此人们相继建立了离心薄层,、,VLC、,FCC,等快速层析分离的方法。其中,VLC,在天然产物分离中应用最多。,该法1969年由澳大利亚,Coll J.C,提出，1977年首次应用于分离澳洲软珊瑚中2个新的二萜化合物,(,Cembrenoids,).,由于经典的柱层析费时费力，需要大量的固定相和洗脱液，工作效率,4,1979年美国,Targett.NM,将该法命名为,Vacuum liquid chromatography (VLC),并且详细报道了实验装置和操作方法。,从此以后，,VLC,便逐渐为广大化学家所接受，并且在实验装置上作了进一步改进。,1979年美国Targett.NM将该法命名为 Vacuum,5,第五章-减压柱色谱分离技术要点课件,6,一、,VLC,特点,VLC,实质上是柱色谱,，它综合了制备薄层（,Preparative PTLC）,和真空抽滤技术,。,VLC,不同于常压柱层析和快速柱层析,Fcc，,因为后两者洗脱剂是连续的，在操作中不会间断；而,VLC,进行溶剂洗脱时，在加洗脱剂后，在柱后减压下全部抽出，每一次洗脱收集一次，抽干后，再更换溶剂，并再进行下一个流分的收集，所以在这一点上,VLC,与,PTLC,多次展开极为相似,。（展开一次后吹干，再展）。,FCC,采用柱前加压，而,VLC,采用柱后加压。,VLC,可分离样品量达几十克，而,FCC,只能分离几克。,VLC,吸附剂经处理后可反复使用,。,一、VLC特点VLC实质上是柱色谱，它综合了制备薄层（Pre,7,二、实验装置与操作,1986年，,Coll,和,Bowden,曾介绍过一种十分简单的用于实验室小规模的减压液相色谱法装置（图,a,b）。,二、实验装置与操作 1986年，Coll和Bowden曾介绍,8,第五章-减压柱色谱分离技术要点课件,9,Pelletier,在1986年，介绍可使用于较大规模的分离的装置（图2）,Pelletier在1986年，介绍可使用于较大规模的分离的,10,1.固定相,；,常采用,TLC,用硅胶、,Al,2,O,3,（,粒度：10,um40um,硅胶60,H,或60,G）,聚酰胺等,2. 装柱,：干法装柱法。,将吸附剂装入漏斗或短柱中，轻轻拍紧或减压拍打或从顶端挤压，直至吸附剂紧密，最后变得坚硬。吸附剂的高度一般不超过5,cm。,1.固定相；,11,3，吸附剂用量,：,（1）对于微量分离,，样品100,mg,可采用直径为0.51,cm,色谱柱或漏斗，吸附剂高度为5,cm，,一般固定相用量为1015：1倍，如图4-,a,可在小试管中收集流分。,（2）对于0.51.0,g,样品,，柱中装有2.54,cm,高度的吸附剂较合适。,（3）对于110,g,样品的分离,，可在柱中装入55,cm,的吸附剂。,（4）较大样品分离,，最好采用250,ml,砂芯漏斗中进行。吸附剂的高度为5,cm。（,如图,b）,可用三角烧瓶收集之。,加大吸附剂与样品比例，可提高分离度。常用比例为30：1300：1,3，吸附剂用量：,12,三、上样,放掉真空后，常压下加入低极性溶剂于吸附剂表面上，减压使溶剂均匀流过吸附剂。如有空隙，需要重装。使柱子抽干后，重复12次，即可准备上样,。,三、上样 放掉真空后，常压下加入低极性溶剂于吸附剂表面上，减,13,A,用低极性溶剂或洗脱剂（如石油醚、正己烷）溶解样品,。,常压下小心加入柱顶端，再加入洗脱剂或溶剂覆盖吸附剂表面，慢慢减压，使样品在柱顶端形成样品层。,B,可也采用固体上样法,。,即先将样品溶于极性溶剂，加入510份吸附剂，旋转蒸发至干后，加到吸附剂的表面上，然后进行洗脱。,A用低极性溶剂或洗脱剂（如石油醚、正己烷）溶解样品。常压下,14,四，,VLC,流动相选择,与柱层析相同，先用,TLC,来选择条件。,VLC,更适用于梯度洗脱,，可用二元，三元混合溶剂系统。一般先用极性较小溶剂，如石油醚、正己烷、环己烷，然后逐渐加大极性（,CH,2,Cl,2,、Et,2,O、AcOEt、CH,3,OH）,极性溶剂的增加开始要缓慢（1%，2%，3%等），然后增加的幅度可逐渐增大（5% 10% 20%等），通常收集2025个流分可将所有成分洗脱。,四，VLC流动相选择与柱层析相同，先用TLC来选择条件。VL,15,五、洗脱与收集,用适当溶剂系统洗脱或用,梯度洗脱,（,gradient elution）。,在常压下，加入溶剂后，将柱抽干，收集为一个流分。真空度要求2070,mmHg；,抽干后再更换溶剂和容器，重复以上操作，并用,TLC,跟踪每一个流分的分离情况（先摸一摸再行动）。,为避免每一流分拆卸漏斗，可采用图,B,的方法，该抽滤甁底部为磨口，减去负压后，更换接受甁。,五、洗脱与收集用适当溶剂系统洗脱或用梯度洗脱（gradien,16,六、应用实例,1.,VLC,法可用于合成反应混合物的分离,delphinine(,翠雀花碱)于220， 0,1 mmHg,下发生裂解反应，生成,Pyrodelphine (,焦翠雀灵)两者的混台物用甲苯：丙酮24：1洗脱，得到896,mg Pyrodelphinines;,甲苯：丙19：1洗脱，得到108,mg Delphinine,分离全程仅仅花费2小时,六、应用实例1. VLC 法可用于合成反应混合物的分离,17,第五章-减压柱色谱分离技术要点课件,18,2. VLC,法用于多种天然化合物的分离,（1）曾有人用,VLC,法对姜中辛辣成分的分离,先将冷冻干燥的姜粉用丙酮提取，经过一系列溶剂分配后，得所需部位。,选用一内径为3.5,cm,的100,ml,的布氏漏斗内装硅胶60（4063,m,Merck,公司）9.5,g,高度3,cm.,300,mg,姜提取物的溶液与硅胶60混和，蒸发除去溶剂后，均匀分布于硅胶柱床表面上，并在样品表面上覆盖一张与漏斗内径相同的滤纸，缓缓加入25,ml,的己烷。待溶剂透过柱床后，开始减压抽干柱床，得第一流分。继续用极性增大的溶剂（己烷乙醚乙醚甲醇）洗脱，每份25,ml，,共得20份洗脱液，利用该法可将姜醇与姜烯酚完全分开。,2. VLC法用于多种天然化合物的分离,19,第五章-减压柱色谱分离技术要点课件,20,（,2）,l0,克,pH 9-12,的,Acontium columbianum,粗提生物碱混合物，使用65,gTLC,用,Al,2,O,3,60 (Merck,H basic,Type E，EM1085),甲苯：氯仿1：4(,VV),洗脱， 于28-30号流份中得到,talatizamine(3)265mg;,氯仿:甲醇19：1洗脱，于35-36号流份中分离得到,cammaconine(4)247 mg。,从两个化台物结构来看，只是在,C18,位上有细微差别若采用,PTLC,法分离，操作极其繁琐、费时，且消耗大量吸附剂与展开剂两法相比，,VLC,明显优于,PTLC,（2） l0克 pH 9-12的 Acontium col,21,第五章-减压柱色谱分离技术要点课件,22,（3）利用,VLC,成功分离海洋腔肠动物的正己烷提取物将在日本冲绳近海采集到的一种软珊瑚腔肠动物,Anemonia sulcatas,切碎后用丙酮浸出，浸液浓缩后用正己烷提取，得提取物12.5,g,溶解于70,ml,正己烷：乙酸己酯8：2的混合溶剂，用滴管将此溶液均匀添加到硅胶表面抽真空，洗脱溶剂从正已烷开始，直至最后用乙酸乙酯，梯度洗脱，每次收集200,mL，,共收集2,L，,耗时2小时,结合,TLC,和核磁共振谱，非常满意地分离和确定了10余种萜类、脂肪酸及其酯、甾体化台物(见图)若用常压柱层析,，,需要370,g,硅胶，费时30小时，耗用10,L,溶剂，才得到同样的效果,（3）利用 VLC成功分离海洋腔肠动物的正己烷提取物将在日,23,第五章-减压柱色谱分离技术要点课件,24,七. 小 结,综上所述，与常压柱层析和快速柱层析相比，真空柱层析,具有以下特点,：,a,分离操作时间短，一般仅需数个小时，,b,装置简单、易得，装柱方便，且要求不高，,c,分离效果好，这主要是由于固定相的细小颗粒(平均10,m)、,较大的表面积( 500,m,2,/g),和合理的装柱方法的原因。,七. 小 结 综上所述，与常压柱层析和快速柱层析相比,25,d VLC,处理量大分离几十克的样品，仍能以较快的速度完成。在,FCC,中，由于玻璃分离柱的限制，处理6,g,以上的样品时就常困难常压柱层析虽然没有样品量的限制，但是极其耗时，所用的固定相的量亦很大，,e. VLC,特别适用于频繁的梯度淋洗，并可使固定相抽干，这又是,FCC,和常压柱层析无法做到的，,f VLC,可以作为进行,HPLC,分离前的较理想的预处理方法,VLC,法也有不足,在使用低沸点溶剂(如石油醚)时要严格控制好真空度，防止大剂量溶剂挥发。,d VLC处理量大分离几十克的样品，仍能以较快的速度完成,26,第二节 半干柱液相色谱,Semi-Dry Column Chromatography,SDC,半干柱液相色谱,即在柱后减压时将固定相抽之半干的液相色谱。,Peter Vinezev,等1991年报道利用半干柱液相色谱法对,Wittig,反应中的差向异构体的分离。,第二节 半干柱液相色谱Semi-Dry Column C,27,一、色谱柱的制备,应用砂芯漏斗或短层析柱，装入1：1硅胶60（70230目）与硅胶,HF（,薄层层析用规格）的混合物。,硅胶床的高度5-8,cm，,再高对分离结果无明显提高。对于较大量样品的分离可用较大的砂心漏斗，同样可以得到较好的分离效果。,有关,SDC,的实际操作数据包括漏斗直径，装入硅胶量，每一洗脱剂量及被分离样品的关系见表：,一、色谱柱的制备应用砂芯漏斗或短层析柱，装入1：1硅胶60（,28,I II III IV V,漏斗直径 200 120 90 65 40,packing：,硅胶6070230目 500 200 100 30 10,硅胶,HF 500,200 100 30 10,每一流分体积 160 80 60 30 8,样品量（,g）,3050 1030 110 15 0.11,29,二、洗脱与分离,：,1.首先用洗脱剂流经吸附剂，抽滤至近干，约有1滴/12秒洗脱液流下。或用湿润的硅胶装柱，吸滤至干，再加40体积的滤液到漏斗中，抽至与吸附剂一直的水平面下。,2. 样品溶解或稀释用洗脱液，加到湿的吸附剂表面上抽至吸附剂表面相平，溶液的厚度不可高于5,mm。,如果溶液的体积较大，可分次抽真空加入，操作同上。当所有的样品溶液已加入，开始洗脱，按照同样方法。每一份洗脱液加入后通过吸附剂抽至半干1滴/12秒。,二、洗脱与分离： 1.首先用洗脱剂流经吸附剂，抽滤至近干，约,30,经过,SDC,分离，下列,Wittig,反应所得顺式 、反式产物可以得到较好的分离。,Z,顺式,E,反式,经过SDC分离，下列Wittig反应所得顺式 、反式产物可以,31,