分光光度法及分光光度计使用方法课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,2012,春季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,2012,春季学期,分光光度法,南方医科大学,生物化学与分子生物学实验教学中心,分光光度法南方医科大学,内容,3,分光光度法的原理,1,如何求被测组分的含量,2,分光光度计的基本结构,分光光度计的使用与注意事项,4,3,内容3分光光度法的原理1如何求被测组分的含量2分光光度计的基,分光光度法,概念：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。,特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分的特点。,分光光度法概念：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其,分光光度法的原理,Lambert,定律,I0,I,入射光强度,透过光强度,L,C,液层厚度,溶液浓度,分光光度法的原理Lambert定律I0I入射光强度透过光强度,分光光度法的原理,Beer,定律,I0,I,入射光强度,透过光强度,L,C,液层厚度,溶液浓度,分光光度法的原理Beer定律I0I入射光强度透过光强度LC液,分光光度法的原理,Lambert-Beer,定律,如果同时考虑液层厚度和溶液浓度对光吸收的影响，将,Lambert,和,Beer,定律合并，描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系。,分光光度法的原理Lambert-Beer定律如果同时考虑,分光光度法的原理,分光光度法的原理,如何求被测组分的含量,1.,利用标准管计算测定物的含量,2.,利用标准曲线计算测定物含量,3.,利用标准系数法求出待测溶液的浓度,4.,利用消光系数法求出待测溶液的浓度,如何求被测组分的含量1.利用标准管计算测定物的含量,利用标准管计算测定物的含量,在相同条件下测定已知浓度（,C,S,）标准液的吸光度（,A,S,），同时也测定末知浓度（,C,U,）的吸光度（,A,U,），,利用标准管计算测定物的含量 在相同条件下测定已知浓度（,利用标准曲线计算测定物含量,先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光度。然后以各管吸光度（,A,）为纵坐标，各管的浓度（,C,）为横坐标，在方格坐标纸上作图。,若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。,利用标准曲线计算测定物含量 先配制一系列浓度由小到大,标准曲线,(,浓度,-,吸光度曲线）,0.2,0.8,0.4,0.6,A,0 1 2,3 4 5,根据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。,C,标准曲线(浓度-吸光度曲线）0.20.80.40.6A,V-1100,型可见光分光光度计,V-1100型可见光分光光度计,0.000,A,T,C,F,MODE,PRINT,0%T,100%T,A,：吸光度,T,：透射比,C,：浓 度,F,：斜 率,MODE,ATCF,切换键,PRINT,确认键,0%T,100%T,校零、下降键,校,100,、上升键,V-1100,分光光度计键盘控制的使用说明,0.000ATCFMODEPRINT0%T100%,V-1100,分光光度计操作步骤,开机，预热,30,分钟。,转动波长旋钮，调所需波长。按 键切换到,T,档。,将黑体放入光路中，合上盖，按 键校零,T=000.0,。,开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上盖，按,键校,T=100.0,合上盖，按 键切换到,A,档,拉动拉杆，将标准、待测液依次放入光路中 ，即可读取其吸光度,A,值。重复,3,次，记录,3,组数据。,读数后，将黑体放入光路中，开盖取出比色杯。,将参比液倒回原试管中，清洗比色杯并倒扣在滤纸上晾干,关机，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。,MODE,0%,MODE,100%,V-1100分光光度计操作步骤开机，预热30分钟。MOD,V-1100,分光光度计 使用注意事项,注意防震、防潮、防光和防腐蚀。,每台仪器所配套的比色皿不能与其他仪器的比色皿单个调换。,不可用手指或毛刷摩擦比色杯的透光面。,盛装参比液时，达到比色杯的,3/4,即可，不宜过多，以防溶液溢出。,比色杯外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸拭净。,注意比色杯的清洁，用后应先用自来水冲洗，再用蒸馏水清洗。,测试结束要及时登记，仪器有问题及时报告。,V-1100分光光度计 使用注意事项注意防震、防潮、防,操作练习实验材料,试剂：,CuSO,4,标准液 （,8mg/ml,）,待测,CuSO,4,溶液,蒸馏水,器材：加样枪、刻度吸管、试管、试管架,V-1100,型可见光分光光度计,操作练习实验材料试剂： CuSO4标准液 （8mg/ml）,操作练习步骤,加入物,B S U,蒸馏水,3ml ,CuSO,4,标准液, 3ml ,CuSO,4,待测液, 3ml,分别取,3,支试管，做好标记，按下表操作：,以空白管,B,调零，在,690nm,处，读取标准管,S,和待测管,U,吸光度,A,值，记录,3,组数据，取平均,A,值，代入公式计算。,操作练习步骤加入物 B,数据处理表格,测定管,各管测定次数,各管平均,A,值,1 2 3,标准管,待测管,各管各测定,3,次，取其平均,A,值再代入公式计算。,数据处理表格测定管各管测定次数 各管平均 A值 1,结果计算,结果计算,南方医科大学,生物化学与分子生物学实验教学中心,Thank You !,南方医科大学Thank You !,