Tan第二章基因工程的工具酶课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Slide,*,本课程内容,第一章 绪论,第二章 基因克隆的工具酶,第三章 基因工程的载体,第四章 目的基因的制备,第五章 目的基因导入和重组子的筛选,第六章 外源基因的表达,第七章 基因操作的根本技术,第八章 植物基因工程及应用,第九章 动物基因工程及应用,第十章 医学基因工程及应用,8/30/2024,1,第二章 基因工程的工具酶,2.1 核酸酶,2.2,甲基化酶,2.3 连接酶,2.4 聚合酶,2.5 修饰酶,8/30/2024,2,2.1 核酸酶,限制性核酸内切酶,2.1.1 限制性核酸内切酶的类型,2.1.2 限制性核酸内切酶的命名法,2.1.3 限制性内切酶的识别序列,2.1.4 限制性内切酶的切割位点,2.1.5 限制性内切酶的切割方式,2.1.6 限制性核酸内切酶的反响体系,2.1.7 限制性核酸内切酶的星活性,2.1.8 限制性核酸内切酶对DNA的消化作用,2.1.9 限制性核酸内切酶酶切本卷须知,8/30/2024,3,几乎所有的生物都能合成自身所需要的酶，包括许多病毒。,酶参与所有生命活动过程，其在细胞内的分布、含量、活性等随生物生长、发育及外界条件的改变而改变。,Ribozyme：,具有催化能力的RNA。,酶不都是蛋白质。,定义：,由活细胞产生，能在体外和体内起同样催化的一类具有特殊空间结构的生物大分子，包括,蛋白质和核酸,等。,8/30/2024,4,限制性内切酶Endonucleosase的发现,50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做,限制,修饰,，它们由三个基因位点所控制：,hsd R,hsd M,hsd S, 十年后，人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理： hsd R-限制性内切酶 hsd M-限制性甲基化酶 hsd S-控制两个系统的表达,8/30/2024,5,1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中别离出两个类内切酶，Hind II和Hind III，为基因工程技术的诞生奠定了根底。 截止到目前为止，已经别离出400余种II类酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约有100种，而实验室常用的有20种 。,8/30/2024,6,III类：识别位点严格专一不是回文序列，但切点不专一，往往不在识别位点内部。,2个亚基组成：,Hsd M甲基化,Hsd R限制性内切酶功能,需要ATP、Mg2+，类似于 I 应用同样受限制。,8/30/2024,9,II类：识别位点回文序列严格专一，并在识别位点内将双链切断。因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。,应用最广，酶最简单(Mg2+)，不需要特殊条件,具有两个亚基：,Hsd M甲基化,Hsd R限制性内切酶功能,切割特异,8/30/2024,10,2.1.2 限制性核酸内切酶的命名法,用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3个字母斜体的略语表示寄主菌的物种名以及菌株型的代号命名。该菌株种中发现的不同的酶按照顺序以罗马字母编号I, II, III等。如：Escherichia coli 用Eco表示。第四个字母代表菌株或株型、变种名，假设酶存在于质粒上，那么需大写字母表示非染色体遗传因子。例：Hind III 从流感嗜血菌株Haemophilus Influenzued 株中别离的第三个酶。EcoR I 表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上。,8/30/2024,11,derivation：,first three names from the latin names of the microorganism that produces them.,first letter(genus), next two letters(species),writing：前三个字母用斜体，其他用正体表示。,如果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌株名称符号,名称最后局部往往包含罗马数字,表示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。,8/30/2024,12,2.1.3 限制性内切酶的识别序列,识别序列,指限制性内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列,专一,通常46个特定的核苷酸对组成,迴文结构,(palindromic sequence),或旋转对称或二重互补对称,8/30/2024,13,recognition sequence:,cleave DNA symmetrically in both strands at short palindromic (symmetrical) recognition sequences to leave a 5-phosphate and a 3-OH. They leave,blunt ends, or,protruding,5- or 3-termini.,Eco,R:, *,5G A A T T C 3,3C T T A A G 5,* ,8/30/2024,14,recognition sequence,enzymes,5 GTT AAC 3,Hpa, blunt end,3 CAA,TTG 5,5 G,AATTC 3,Eco,R 5protruding end,3 CTTAA,G 5,5 A,AGCTT 3,Hin,d 5protruding end,3 TTCGA,A 5,5 G,GATCC 3,Bam,H 5protruding end,3 CCTAG,G 5,5 CTGCA,G 3,Pst, 3protruding end,3 G,ACGTC 5,8/30/2024,15,识别序列在DNA上出现的概率,1/4nn识别序列核苷酸组成的数目,Sau3A 4 碱基酶, 那么每隔256(44) bp会出现一个识别位点。,EcoR I、Pst I 6碱基酶，那么每隔4096 (46) bp会出现一个识别位点。,Not I (8bp)= 1/48 65536，稀切酶 rar cutters: 指识别序列长和识别序列富含GC或富含AT的限制性核酸内切酶。,仅是理论推测,8/30/2024,16,同裂酶,(isoschizomer)或,异源同工酶:,不同来源的限制酶可切割同一靶序列,Bam,H I,和,Bst,I,具有相同的识别序列,G,GATGC,同尾酶(isocaudiners)：,来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。,两个同尾酶形成的黏性末端连接之后，,一般情况下,连接处不能够再被其任何一种同尾酶识别。如：,Bam,H I,识别序列：G,GATCC,Bgl,II,识别序列： A,GATCT,8/30/2024,17,远距离裂解酶(distant cleavage)：,识别位点与切割位置不一致。如：,Faq,I,GGGAC (10/14),5,-,GGGAC,NNNNNNNNNN,NNNNNN-3,3,-,CCCTG,NNNNNNNNNN,NNNNNN-3,可变酶：,识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的。如：,Bse,J I,GATNN,NNATC,Subset酶：,一种酶的识别序列包含于另一些酶的识别序列之中。如：,Ehe,I,GGC,GCC,Hin,6I GC,GC,8/30/2024,18,2.1.4 限制性内切酶的切割位点,切割位点：DNA在限制性核酸内切酶的作用下，两条链断开的位置。,一般在识别序列的内部或两侧附近。,以或 表示。,环状DNA分子上某个限制性内切酶有n识别位点，完全切割得到n个DNA片段。,线性DNA分子，那么会得到n+1个DNA片段。,8/30/2024,19,Restriction digests,digestion of,plasmid,or,genomic,DNA,for analytical or preparative purposes, using commercial enzymes and buffer solutions.,All RE require Mg2+,usually at a concentration of up to 10mM,but different enzymes require different pHs,NaCl concentrations or other solution constituents for optimum activity.,8/30/2024,20,2.1.5 限制性内切酶的切割方式,交错切割staggered cut:,DNA双链断开的位置对称地分布在识别序列中心位置的两侧，使切割后的DNA末端为单链突出的黏性末端。如：BamH I -GGATG C-,-C CTACG-,平切割：,DNA双链断开的位置处在识别序列的对称中心，使切割后的DNA末端为平齐的平末端。,如：Nsb I TGC GCA,8/30/2024,21,粘性末端 和平末端,粘性末端 (cohesive terminus/sticky ends)：,DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。,3粘性末端： 3 突出的黏性末端DNA末端的3端比5 长,5 粘性末端： 5 突出的黏性末端DNA末端的5端比3 长,平末端blunt ends： DNA片段的末端是平齐的。,8/30/2024,22,同尾酶isocaudamer,指来源不同，,识别序列不同,，但可以产生,相同黏性末端,的限制性内切酶。,两个同尾酶形成的黏性末端连接之后，,一般情况下,连接处不能够再被其任何一种同尾酶识别。如：,Bam,H I,识别序列：G,GATCC,Bgl,II,识别序列： A,GATCT,8/30/2024,23,2.1.6 限制性核酸内切酶的反响体系,底物DNA,2.1.6.2 酶量,2.1.6.3 反响缓冲液,2.1.6.4 反响温度,8/30/2024,24,2.1.6.1 底物DNA,进行大量酶切时，先要确定 RE 的浓度。一般 1U RE 于 37 条件下作用底物 DNA 1h 以上可切割 1 g DNA 。一般来说，要用 2 3 倍才能保证完全消化，对基因组 DNA 尤其如此。 酶切基因组 DNA 是否完全可通过紫外观察结果来判断，如看到 DNA 片段呈均一递减的一条区带，那么表示酶切完全。,进行大量酶切时，先要确定 RE 的浓度。一般 1U RE 于 37 条件下作用底物 DNA 1h 以上可切割 1 g DNA 。一般来说，要用 2 3 倍才能保证完全消化，对基因组 DNA 尤其如此。 酶切基因组 DNA 是否完全可通过紫外观察结果来判断，如看到 DNA 片段呈均一递减的一条区带，那么表示酶切完全。,水稻基因组的,Eco,R I酶切,8/30/2024,25,2.1.6.2 酶量,根据酶的活性和DNA底物的量而定。,限制性核酸内切酶活性单位定义：,在酶的最适反响条件下，在50l容积中，60分钟内完全切割1g DNA所需的酶量为1个酶活性单位unit 或U,与DNA分子上识别位点的密度有关：,密度大用酶量多；密度小用酶量少。,8/30/2024,26,2.1.6.3 反响缓冲液,Tris-HCl or Tris-HAc,MgCl,2,or MgAc,2,KAc or NaCl,二硫基苏糖醇,(,DTT) or,-巯基乙醇(ME),牛血清白蛋白(BSA),pH 7.58.0 at 37C,8/30/2024,27,2.1.6.4 反响温度和时间,大多数限制酶的反响温度为370C。,个别特殊的内切酶那么需要在300C 、500C、600C或650C的温度下进行切割。,反响时间：一般在适宜的缓冲液和温度条件下，每微克DNA用15单位的酶，保温12小时。,8/30/2024,28,2.1.7 限制性核酸内切酶的星活性,星活性star activity：,指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反响，导致出现非特异性的DNA片段的现象。,易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoR I*,8/30/2024,29,引起星活性的原因：假设使用buffer不當, 會有star activity，而star activity是指限制酶對所作用的DNA及序列失去專一性, 當酶辨認切割位置的能力降低，導致相似的序列或是錯誤的辨認序列長度也會作用，而產生錯誤的結果。所以當DNA同時以兩種限制酶處理時，選擇可使兩種酶之活性反應均可達75以上的restriction buffer，假设找不到適當的buffer則先加低盐的buffer使其中一酶作用後，在参加高盐buffer使另一酶作用，假设無法以鹽的上下分別参加不同的buffer，則先参加一種buffer作用後，加3M NaOAc/95alcohol沉澱DNA，再加另一種buffer作用。,8/30/2024,30,2.1.8 限制性核酸内切酶对DNA的消化作用,单酶切: 加单一酶,双酶切:加两种酶,局部酶切: 一般通过控制酶切时间, 使DNA局部酶切,底物位点优势效应: 酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同,8/30/2024,31,2.1.9 酶切本卷须知,选择正确的酶,DNA的纯度和浓度,反响体系甘油的量5%酶保存在50甘油中，故所加酶液体积最多为酶切反响总体积的1/10。,酶保存在200C；使用时在冰浴上操作。,反响体系各成分都加完后，再加酶。,每次取酶液用新的枪头，防止交叉污染。,酶切样品多时，可先取一定量的酶液，稀释后再分装。,防止任何可能引起酶蛋白变性的因素，如：气泡、去污剂等。,8/30/2024,32,2.2,甲基化酶,在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应。,一大肠杆菌中的甲基化酶 dam甲基化酶: 可在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有5GATC3的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如Bcl ITGATCA，但BamH IGGATAA那么不会因为N6A的甲基化而失去活性，因为这两种酶对底物的特异性不同。 dcm甲基化酶 此酶在序列5CCAGG3或5CCTGG3中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoR II。,8/30/2024,33,二 甲基化酶在基因工程中用途许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切割。如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸SAM的甲基转移到EcoR I识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使DNA免受EcoR I的切割。,8/30/2024,34,2.3 DNA连接酶 (DNA ligase),2.3.1 E. coli 和T4 DNA连接酶,2.3.2 DNA片段之间的连接,2.3.2.1 具黏性末端的DNA片段之间的连接,2.3.2.2 具平末端DNA片段之间的连接,2.3.2.3 DNA片段末端修饰后进行连接,2.3.2.4 DNA片段加连杆linker后的连接,8/30/2024,35,2.3.1 DNA连接酶DNA ligase,来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，,催化双链DNA片段紧靠在一起的3,羟基末端和5,磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键。,用途,：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复制和损伤后的修复中都起关键作用。,提取,：许多原核和真核生物及病毒中。,8/30/2024,36,E. coli,DNA ligase,和T,4,DNA连接酶,E.coli DNA ligase:,Mr=74000,作用于5端带磷酸基团的DNA底物,NAD+可促进该催化反响,分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。,用途: cDNA第二链合成。,8/30/2024,37,T4 DNA ligase:,一条多肽链(Mr=68000)，还可作用于 RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子。,日常用的最多。,T4 RNA ligase:,由噬菌体编码,催化单链DNA或RNA连接,。,主要用途是对RNA进行3末端标记,8/30/2024,38,2.3.2.1 具黏性末端的DNA片段之间的连接,一般较好连接，直接参加缓冲液和T4 DNA连接酶就可以完成。,8/30/2024,39,2.3.2.2 具平末端DNA片段之间的连接,连接效率较粘性末端低，尽量防止采用。参加缓冲液和T4 DNA连接酶就可以完成。,8/30/2024,40,affecting factors,T：多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15以下,然而保持连接酶活性的最适温度却是37, 因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷。经常采用12.54-15。,DNA concentrations：外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍,防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体,time：O/N better,8/30/2024,41,2.3.2.3 DNA片段末端修饰后进行连接,DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，也称人工接尾法：在末端核苷酸转移酶的催化下，在连接处的末端分别加上AAA，另一端加上TTT。,粘性末端修饰成平末端后进行连接：一端是粘端，另一端是平端。,DNA片段5端脱磷酸化作用后连接：防止自身连接环化。,8/30/2024,42,2.3.2.4 DNA片段加连杆linker后的连接,连杆/衔接物linker：化学合成的812个核苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。,衔接头/接头adaptor：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。,都具平末端的两种DNA片段的加连杆的连接,分别具平末端和粘性末端的两种DNA片段的加连杆的连接,分别具非互补粘性末端的两种DNA片段加连杆的连接,8/30/2024,43,2.4 聚合酶,2.4.1 DNA聚合酶,2.4.2 反转录酶,2.4.3 RNA 聚合酶,8/30/2024,44,2.4.1 DNA聚合酶 (DNA polymerase),E.coli,（全酶）,DNA聚合酶I,Klenow片段,T7 DNA聚合酶,Taq DNA 聚合酶,性质,5,3,聚合酶,3,5,外切酶,5,3,外切酶,5,3,聚合酶,3,5,外切酶,无小亚基活性,5,3,聚合酶,3,5,外切酶,聚合速度和持续合成能力强,5,3,聚合酶,耐高温,持续合成能力高,用途,缺口翻译法合成放射性标记的探针,使粘性末端转换为平末端,随机引物法合成放射性标记探针,修补,3,隐蔽的粘性末端为平末端,DNA,3,末端标记,cDNA,第二链的合成,测序酶,DNA,3,末端标记,使粘性末端转换为平末端,PCR,8/30/2024,45,2.4.2 反转录酶 (reverse transcriptase),依赖RNA的DNA聚合酶RNA-dependent DNA polymerase,最常见的商用反转录酶：来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒avian myeloblastosis virus, AMV。,AMV反转录酶具有反转录酶活性和RNaseH活性,反转录酶活性可以单链RNA或DNA为模板，以寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷olig(dT)或随机寡聚脱氧核苷酸为引物合成同模板序列互补的互补链。但DNA指导的DNA聚合酶特性，不具有35外切酶活性，聚合时无校正功能。,RNaseH具有核酸外切酶活性，能以53或35方向特异地降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链。,最主要的用途：以mRNA为模板合成cDNA。,8/30/2024,46,2.4.3 RNA 聚合酶 (RNA polymerase),以DNA为模板合成mRNA，不需引物，但必须有启动子。,常用的RNA聚合酶来源与SP3、T3和T7噬菌体。,用途：RNA探针的合成。,8/30/2024,47,2.5 修饰酶,末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl trasnferase/terminal transferase)：,不依赖于DNA的DNA聚合酶，,来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3,端增加一个或多个脱氧核苷酸。,T4多核苷酸激酶(bacteriophage T4 polynucleotide kinase),(,next page,),碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase):(,next page,),Topoisomerase,改变共价闭合双链DNA分子的结构,8/30/2024,48,T4多核苷酸激酶(bacteriophage T4 polynucleotide kinase)：,激酶:,对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。,用途：,放射性标记DNA链的5,末端，探针标记,Maxam-Gilbert化学法的DNA序列分析；使缺少5磷酸的DNA片段和合成接头磷酸化。,该酶很难纯化,酶制品经常不纯。,铵离子是该酶的强烈抑制剂,处理前,DNA不能溶解于含铵盐的缓冲液中。,低浓度的磷酸也可抑制该酶活性。,8/30/2024,49,碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase):,磷酸酶：去除核酸末端磷酸基团的酶。,细菌碱性磷酸酶(BAP)：E.coli中别离,牛小肠碱性磷酸酶(CIP)： 牛肠道别离，切除DNA、RNA和dNTP上的5磷酸基团, 从DNA片段上除去5磷酸以防自身连接。,BAP活性更高, 对热和去污剂抗性更强,因此脱磷酸化后很难完全抑制BAP活性。,除去CIP可用蛋白酶K降解,8/30/2024,50,nuclease,以核酸为底物的水解酶,按底物专一性分：,RNase、DNase、非专一性核酸酶,按作用位点分：,内切,或外切酶,5-核酸酶或3-核酸酶,常用:,BAL31核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、RNaseA,RNaseT1、DNase、外切核酸酶、噬菌体,外切核酸酶等。,许多核酸酶兼有内切和外切活性,8/30/2024,51,核酸酶的分类,内切酶,非专一性,外切酶,3-核酸酶,核酸酶 内切酶,5-核酸酶,RNA,外切酶,专一性 非限制性, 内切酶,限制性,DNA,外切酶,8/30/2024,52,复习思考题,1.名词解释：,限制性核酸内切酶；回纹结构；同尾酶；同裂酶；黏性末端；平末端；限制性核酸内切酶的酶活性单位U；限制性核酸内切酶的星活性；连杆linker；衔接头adaptor,2. 限制性核酸内切酶反响体系的组成是什么？,3. 引起限制性核酸内切酶星活性的可能因素有哪些？,4. DNA片段之间的连接方式有哪些？,5. DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶、末端转移酶、多核苷酸激酶和碱性磷酸酯酶有哪些主要特性？它们在基因工程中的主要用途分别是什么？,8/30/2024,53,