分子病理学技术进展及临床应用课件

,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second Level,Third Level,Fourth Level,Fifth Level,分子病理学技术进展及临床应用,(第一部分),分子病理学技术进展及临床应用(第一部分),来自临床的问题,来自临床的问题,Contemporary Understanding of Carcinogenesis by molecular biology,as our introduction,Contemporary Understanding of,More than 100 years ago (1830), British physician,Thomas Hodgkin,discovered a type of Lymphoma with his naked eyes.,In the time, obviously Thomas Hodgkin did never know R-S cells in his cases before the microscope available in clinic.,More than 100 years ago (1830),分子病理学技术进展及临床应用课件,分子病理学技术进展及临床应用课件,While at present time, for us, what can be down with,our naked eyes,rather then with microscope or modern molecular techniques?,While at present time, for u,The,cellular elements,in,lymphoid & hematopoietic tumors are the key to understand and diagnose their diseases.,Even more,the molecules,in the related cells are the key, especially involved in the development and differentiation of lymphoid & hematopoietic cells,That is the beginning of our story today.,The cellular elements in lymph,Understanding of Lymphocyte Development,1950s-2010,structure and function of lymphoid tissue,Germenal Center(GC)：structure，function，transformation,Capsular and afferent lymphatics,Cortex,Cortex,Medulla,Hilus,Efferent lymphatic vessels,Trabeculae,Medullary sinuses,Medullary cords,G C,Follicle,Thymus-depending zone,Subcapsular sinus,Reticulum supporting,lymphatic tissue,Understanding of Lymphocyte De,分子病理学技术进展及临床应用课件,分子病理学技术进展及临床应用课件,Could you recognize the following cellular elements in lymph node?,Germinal center,Mantle zone,Marginal zone,T-zone,Could you recognize the follow,Understanding based,on 70s of last Century,Interfollicle zone,T lymphocyte,T lmmunocyte,B lmmunocyte,Lymphocyte transform in center of Follicle,Memory cell,Plasma cell,Paradigm of Lymphocyte transform,B lymphocyte,FDC,B non-cleaved cell,B cleaved cell,Only by morphology,Understanding based on 70s of,Centroblast,Blast,Immuoblast,Macrophage,FDC,Centrocyte,T cell,Macrophage,FDC,Lennerts Presumption based,on 80s of last Century,Germinal center,Dark zone,Light zone,Mantle zone,Mantle zone,Marginal zone,Proliferation zone,Selected for apoptosis,On-going mutation,by morphology and immunotyping considering molecular events,CentroblastCentrocyteLennerts,Update to B-lymphocyte development model in 2000s,Update to B-lymphocyte develop,B cell differentiation by immuno-markers,B cell differentiation by immu,B cell differentiation with anatomical sites of various stages,B cell differentiation with an,Could you recognize,cellular elements,as follows,in lymph node?,Germinal center,Mantle zone,Marginal zone,T-zone,Could you recognize cellular e,Understanding of B cell differentiation until 2005 by H Stein,Understanding of B cell differ,Naive B cell,DC,Somatic Hypermutation/,Affinity Maturation,Class Switching,IGM IgG, IgA,Memory,B cell,Plasma cell,Apoptosis,Germinal Center,V(D)J recombination,Apoptosis,Antigen,DC,Centroblasts,Centrocytes,Bone Marrow,Post-Germinal Center,B,B,B,B,B,B,B,B,B,B,T,T,Precursor,B Lymphoblast,BCL2 ,IRF4 ,BCL2 ,BCL6 ,Decreased,Affinity,Increased,Affinity,BCL6 ,No BCR,T cell-rich zone,Intact BCR,?,IgHVclonal rearrangement,somatic hypermutation!,Naive B cellDCSomatic Hypermut,What happen to T cell since it has been less mentioned,What happen to T cell since it,The contemporary understanding of B and T cell differentiation,2009-2010,Understanding of the lymphocyte differentiation and transformation by,multiple approaches,inl.,morphology,immunotyping,and,molecular means,.,The contemporary understanding,一、临床分子病理学常用方法,免疫组织化学,基因克隆性重排的检测,FISH及,CGH,等位基因不平衡分析,杂合性缺失（LOH）的检测,微卫星DNA不稳定性（MSI）的检测,For post-graduate program Clinical pathology-ZR-201509,一、临床分子病理学常用方法免疫组织化学For post-gr,（一）免疫组织化学及其应用,（一）免疫组织化学及其应用,1免疫组织化学的相关理论和技术,11免疫组织化学的工作原理,已知的特异性抗体或抗原能特异性结合,通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶，金属离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色）,借助显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构,1免疫组织化学的相关理论和技术,For post-graduate program Clinical pathology-ZR-,For post-graduate program,22免疫组织化学的应用范围及优点：,221应用范围：,(1)提高病理诊断准确性,(2)对疾病的预后和治疗的意义,激素,(3)癌基因蛋白的应用,(4)对肿瘤增生程度的评价,ki-67,PCNA,(5)微小病灶的发现,微小癌，微小病灶（如,羊水栓塞,）,(6)在肿瘤分期上的意义,(7)指导肿瘤的治疗,(8)免疫性疾病的辅助诊断,(9)病原微生物的检测,For post-graduate program Clinical pathology-ZR-2014,22免疫组织化学的应用范围及优点：For post-gr,2常用免疫组织化学方法：,A、一步法,B、二步法,C、三步法,D、,多步法,间接法,金银法,PAP和BigBee,APAAP,ABC法,EnVision法,BT法（CSA：Catalyzed signal amplification）,1:50、1:200、1:500、1:500、1:1000、1:5000、1:5000, 1:10,6,2常用免疫组织化学方法：,E.,ABC法,E. ABC法,F.,EnVision,近年来的新方法,:,F. EnVision近年来的新方法:,G. CSA,法（Catalyzed signal amplification）,BT法,G. CSA法（Catalyzed signal am,For post-graduate program Clinical pathology-ZR-20120910,For post-graduate program,CSA原理图,CSA,法,CSA原理图CSA法,H. 免疫组化-原位杂交的,联合应用,H. 免疫组化-原位杂交的联合应用,I. TUNEL-免疫组化在细胞凋亡检测中的应用,凋亡是一个基因调控、耗能的主动过程，也称之为程序性细胞死亡,(programmed cell death,，,PCD),。,凋亡是单个细胞或数个细胞的死亡，死亡细胞的质膜,(,细胞膜和细胞器膜,),不破裂，不引发死亡细胞的自溶，也不引起急性炎症反应。,I. TUNEL-免疫组化在细胞凋亡检测中的应用,形态学特点：,电镜下,，凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致密，细胞器密集、不同程度退变；核染色质致密，形成形状不一、大小不等的团块边集于核膜处，进而胞核裂解、胞浆多发性芽突；胞浆芽突迅速脱落，形成许多,凋亡小体,（,apoptotic bodies,）。凋亡小体外被以胞膜，其胞浆中含有细胞器，核碎片可有可无。凋亡小体迅即在局部被巨噬细胞和相邻的其他细胞,(,例如上皮细胞,),吞噬、降解。细胞凋亡和细胞坏死的超微形态比较。,光镜下,，凋亡细胞胞浆浓缩，强嗜酸性，可有可无固缩深染的核碎片，故有称之为,嗜酸性小体,（,councilman bodies,）。,形态学特点：,生化特点：,由基因调控，是耗能的主动过程,Ca,2+,/Mg,2+,依赖的核酸内切酶活化,DNA,断裂以核小体为单位,DNA,电泳呈阶梯状图谱,生化特点： 由基因调控，是耗能的主动过程,TUNEL法检测凋亡,（,Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,-mediated dUTP nick-end-labling ）,TdT介导的dUTP缺口末端标记,TdT,酶,(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase),末端脱氧核苷酸转移酶（,TUNEL,）,TUNEL法检测凋亡TdT酶 (Terminal Deoxy,TUNEL,法示意,间接法：,Digoxigenin-dUTP,TUNEL法示意,TUNEL,染色：直接法,参照德国宝灵曼公司原位末端标记试剂盒操作手册，其主要步骤如下：,（1）切片脱蜡至水，双蒸水、PBS液洗；,（2）微波处理：切片置于盛有枸椽酸缓冲液（0.01M，PH6.0）的容器中微波加热.,（3）PBS液洗 5min3次；,（4）每张切片滴加20ugml蛋白酶K液，放于湿盒中37孵育15min；,（5）切片置于0.3%H,2,O,2,-甲醇液中室温放置20-25min；,（6）滴加TUNEL反应混合液，37湿盒中孵育60-90min；,TUNEL反应混合液主要成分：Bio-11-dUTP,TdT酶,（7）PBS液洗5min3次；,（8）滴加链霉菌素,辣根过氧化物酶液（用PBS液稀释成1:200）37湿盒中孵育30min，,（9）滴加新鲜配制的DAB-H,2,O,2,液，镜下观察2-10min显色；,（10）自来水充分洗涤；,TUNEL染色：直接法,免疫组化多重标记的应用,以,EnVision,方法为例,For post-graduate program Clinical pathology-ZR-2014,免疫组化多重标记的应用以EnVision方法为例For po,免疫组化多重标记的应用,在淋巴瘤研究中的应用,ABC-DAB/SAB-AP-vector blue,示：CD30+H/RS细胞表达P53 、BCL-2,2.,ABC-DAB/SAB-AP-vector red,示：H/RS细胞、T细胞和B细胞的分布情况。,3.,TUNEL-DAB/ SAB-AP-vector red,示: CD30+H/RS细胞,免疫组化多重标记的应用在淋巴瘤研究中的应用,4免疫组织化学的质量控制及方案设计,41Ab的保存和配制,保存性分装,即用型,配制：选最佳点,4免疫组织化学的质量控制及方案设计,42正确的设计和结果判断,1. 试剂对照,确定第一抗体和第二抗体是否具有抗原特异性。其中要确定第一抗,体对阳性组织的最佳稀释度；第二抗体对组织蛋白的无反应性。,阴性试剂对照,：,用一个阴性试剂替代一抗或控制步骤,目的： 用来评价非特异性染色，并较好解释抗原部位的特异性标记。,42正确的设计和结果判断,For post-graduate program Clinical pathology-ZR-2014,For post-graduate program,2. 组织对照,阴性组织对照,：,例如:正常肝组织用于对照HBsAg阳性的肝细胞检测,再者,如果大规模使用抗体，一张切片的阴性区，可能就是另一张切片（不同Ab）的非特异性染色对照。,阳性组织对照,：,有已知的、含目标抗原的样本,目的： 监控抗原是否存在；监控抗原敏感性是否丧失。,组织内对照,：,可以消除不同组织间固定造成的差异，另一个优点是可以不使用阳性,对照标本。,2. 组织对照,阴性试剂对照,阴性组织对照,阳性组织对照,组织内对照,研究组,+,-,-,+,+,-,定位,+/-,+/-,理论预期,实测值,非定位,意义,？,For post-graduate program Clinical pathology-ZR-20130909,阴性试剂对照阴性组织对照阳性组织对照组织内对照研究组+-+,BIGBEE图,BIGBEE图,结果判断标准,由于影响因素很多，如不同厂家生产的同一种抗体特异性和敏感性的差异、所用的检测试剂盒特异性和敏感性的差异、技术熟练程序以及固定包埋等，其结果判断的标准化问题尚难统一。,有一些原则必须掌握：,阳性细胞定位是否明确，是胞膜、胞浆还是胞核阳性,间质清晰，无背景着色。,免疫组化的,定量问题,阳性细胞要在5%以上，才能定为阳性。,参考评价：,50% +,结果判断标准,5临床病理学免疫组化,“,套餐,”,式标记：,51,临床病理学常用,“,套餐式标记,”,选用,Keratin,Vimentin,S-100,LCA leukocyte common antigen,5临床病理学免疫组化 “套餐”式标记：,方案一,方案一,分子病理学技术进展及临床应用课件,分子病理学技术进展及临床应用课件,方案二,方案二,方案三,可疑神经内分泌肿瘤,CgA,NSE,蛙皮素,方案三可疑神经内分泌肿瘤 CgA,方案四,方案四,思考复习题,请结合自己的专业，简单设计一个免疫组织化学标记的方案来研究一个课题,.(,一抗和二抗的名称和来源、一抗的定位预测；实验方案、生物学意义和临床意义、实验设计（每个对照组的意义）、结果判断。,2.,免疫组化的应用范围,3 .,何谓,“,套餐式,”,免疫标记,?,举两例说明,思考复习题请结合自己的专业，简单设计一个免疫组织化学标记的方,6.免疫组化应用范围及,应用,”,盲点,”,。,分子病理学技术进展及临床应用课件,