单抗系列培训完整版PPT

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单克隆抗体,分享人：李 行,2017.08,单抗基本概念,单抗发展历程,单抗制备原理,单抗实际应用,实验存在的问题,报告内容,单抗简介,单抗简介,1975,年,Kohler,和,Milstein,建立了淋巴细胞杂交瘤技术，使经绵羊红细胞（,SRBC,）免疫的小鼠脾细胞和小鼠的骨髓瘤细胞融合，创立了第一个,B,细胞杂交瘤细胞株，获得了抗,SRBC,的单克隆抗体。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。因此说单抗技术是免疫学，乃至医学史上的一个里程碑。,抗体生产技术的三个时代：多克隆抗体,单克隆抗体,基因工程抗体,基本概念,1.,抗原,1.1,传统抗原基本概念：,能启动机体的免疫应答，且能与其免疫应答产物,(,抗体或免疫效应细胞,),特异性结合，并产生一系列生物学效应的物质。,1.2,现代抗原概念：能被,B,细胞免疫球蛋白受体识别或与主要组织相容性复合体（,MHC,）结合后能被,T,细胞受体识别的物质统称为抗原。,1.3,抗原的两种基本特性：,（,1,）免疫原性：指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答（产生特异性抗体及免疫效应细胞）的性质。,（,2,）反应原性：指抗原分子与免疫应答产物（抗体或免疫效应细胞）发生特异性结合的性质。,1.4,完全抗原与半抗原,（,1,）完全抗原：具有免疫原性和反应原性的物质。,（,2,）半抗原,又,称不完全抗原：无免疫原性，只有抗原性的物质。,（,3,）载体（,carrier,）：与半抗原结合使其成为免疫原的物质。如,BSA,，,OVA,半抗原,+,载体􀃆完全抗原,1.5,抗原表位（抗原决定簇）：,指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。即抗原上可以引起机体产生抗体的分子结构。一个抗原可以有许多不同的抗原决定簇。,抗体（,Antibody,Ab,）基本概念：机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末,B,细胞,-,浆细胞合成、分泌的一类能与抗原特异性结合的具有免疫功能的免疫球蛋白。,3.,免疫球蛋白（,immunoglobulin, Ig,）：,具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。,2 .,抗体,备注：,Ab=,Ig, Ig,Ab,Ab,是功能描述，,Ig,是化学结构的描述。,基本结构：,重链（,heavy chain,，,H,）,2,条,轻链（,light chain,，,L,）,2,条,可变区（,variable region, V,区）,恒定区（,constant region, C,区）,超变区（,hyper-variable region, HVR),又称互补决定,区（,complementarydeterminingregion, CDR,）,骨架区（,framework region,FR,）,铰链区（,hinge region,）,3.1,免疫球蛋白的结构,可变区,Ig,的两条长链称为重链（,Heavy chain,，,H,链），,重链可分为：, ,，对应的,Ig,的种类：,IgM, IgG, IgA, IgD, IgE.,Ig,的两条短链称为轻链，可分为,，,；每个,Ig,分子的两条轻链完全相同。,4.,多克隆抗体,（,polyclonal antibody,PcAb,）,：,指由不同,B,细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如：免疫血清（含多种特异性抗体）。,5.,单克隆抗体,（,monoclonal antibody,，,McAb,）：是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。,6.,细胞克隆：,由一个细胞增殖而成的细胞群体。,克隆能够保持亲本的绝大部分性状。,8.,多克隆抗体和单克隆抗体的优劣势,PcAb,McAb,特异性,低,高,均一性,无,有,敏感性,差,强,亲和力,亲和力较强,亲和力不强,成本、时间,制备相对便宜，时间短,成本高，时间长,杂交瘤技术基本原理,制备流程,融合,在具有筛选作用的培养基中培养,筛选出分泌抗体的细胞，进行克隆化,SP2/0,B,细胞和,SP2/0,死亡,1.,抗原制备,不管是制备单抗还是多抗，抗原的设计与制备都是一个非常重要的问题，设计或者制备得不好的抗原有可能完全不能免疫出抗体来。,1.1,一个良好的抗原必须具备的条件：,（,1,）,分子量：,一般是,分子量越大，免疫原性越强，,对于多肽或蛋白质类的抗原来说，一个抗原决定簇（又叫表位，,epitope,），通常由,6-8,个氨基酸残基组成。而平均每,5-10kD,才有一个表位，因此分子太小的多肽或蛋白是很难有一个表位的。,抗体制备过程及影响因素,（,2,）化学结构与组成：结构尽量复杂。,简单重复的物质是不具有免疫原性的，拿明胶来说，它的分子量非常大，而且外源性也很强，但是组成明胶的氨基酸多为直链氨基酸，在体内容易被降解，因此它的免疫原性很弱,。,蛋白质：,a.,氨基酸组成：含芳香族氨基酸（特别是酪氨酸），免疫源性强。,b.,结构：环状的免疫原性强；直链，免疫原性弱。,多糖：,具有免疫原性，较蛋白质弱。,核酸：,多无免疫原性。,（,3,）,外源性强。,在个体形成的早期就对自身物质形成了免疫耐受，因此如果和机体内的物质完全一样或者是相似就很难引起机体的免疫应答。,（,4,）可降解性好。,作为抗原，必须是可以降解的，塑料、不锈钢等难降解的物质免疫原也很弱。含,L-,氨基酸的蛋白质易降解，具有免疫原性。但是由,D-,型氨基酸组成的物质免疫原性很弱，同样是因为机体不能降解,D-,氨基酸组成的蛋白或多肽。,2.,免疫方案,2.1,动物的选择：,常见的可以用来制备抗体的动物有：小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、绵羊、山羊、马、驴、奶牛，还有用鸡或者鸭的。,需考虑的问题：,第一个问题是能否具有较好的免疫效果,.,第二个问题是抗血清产量的问题,.,2.2,免疫佐剂,：,先于免疫原或同时与抗原混合注射机体可增强抗原的免疫原性的物质。,（,1,）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果，如细胞类抗原、电泳跑蛋白胶。,（,2,）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂。,油性佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂；,无机化合物,微生物及其产物,脂质体,细胞因子,2.4,抗原与佐剂的乳化,2.5,免疫途径：,（,1,）体内免疫：皮下，腹腔，肌肉，静脉等,（,2,）体外免疫：较少。,2.3,免疫剂量,：根据免疫原、免疫途径、免疫动物、免疫佐剂有关。,一般的免疫剂量是微克级别。,2.6,免疫时间间隔：,一般间隔,2-3,个星期。,抗体产生的一般规律,初次应答：抗原初次进入机体产生的应答。,特点：潜伏期（诱导期）长（,7-10,天）；,抗体的种类以,IgM,为主；,抗体的亲和力低；,维持时间短；,总抗体水平低。,再次应答：抗原再次进入机体所产生的应答。,特点：潜伏期短（约,2-3,天）；,抗体的种类以,IgG,为主；,抗体的亲和力比初期应答明显增强；,维持时间长；,总抗体水平高。,3.,免疫鼠血清的采集和检测,小鼠第三次免疫,1,周后，免疫组对小鼠进行眼球静脉采血，收集血清，血清,交由,检测负责人，该负责人对血清进行检测,。,（,1,）免疫酶技术：,ELISA,，,IPMA,（,2,）免疫荧光技术：,IFA,（,3,）间接血凝实验,（,4,）放射免疫检测,4.,杂交瘤细胞株的建立,SP2/0,的准备,饲养层细胞,的制备,脾细胞,（,B,细胞）,的制备,脾细胞,和,SP2/0,的,融合,单克隆抗体的制备与鉴定,杂交瘤的筛选,细胞的冻存和复苏,实验关键！,4.1,试剂和耗材,4.1.1,试剂：,DMEM,、,胎牛血清（,FBS,）、,HAT,、,HT,、,50%PEG,， 青、链霉素、生理盐水,;,4.1.2,仪器：,生物安全柜、二氧化碳培养箱、水平离心机、倒置显微镜；,工具：止血钳，剪刀、直头眼科镊子、弯头眼科镊子,4.2,进行细胞融合的前一天，准备饲养层细胞：,8-10,周龄,BALB/c,雌性小鼠,;,用注射器向腹腔内注射,DMEM,，轻轻揉压小鼠腹膜，抽出腹腔内液体，收集到一个 离心管中，反复操作,3,次左右,;,离心,1000rpm ,5min ,弃上清，重悬细胞，铺板密度,2x10,5,。,实验流程,4.2.2,准备饲养层细胞,:,取静止状态的腹腔巨噬细胞,4.2.1,骨髓瘤细胞,SP2/0,的培养：,对数生长期,4.2.3,脾细胞,（,B,细胞）,的制备,：,融合前,3,天加强免疫,小鼠,（,1,）注射器反复吹打法,（,2,）研磨法,（,1,）生物方法：病毒诱导的细胞融合,（,2,）化学诱导：,PEG,诱导,50%PEG(10004000),（,3,）物理诱导：电融合,4.2.4,脾细胞,和,SP2/0,的,融合：,融合方法主要有以下几种方法,细胞融合,融合过程中的注意事项：,（,1,）,SP2/0,细胞和免疫脾细胞的数量比例适当，,1:5-1:10,；,（,2,）两种细胞状态要好，洗吹细胞一定要轻柔；,（,3,）,PEG,融合之后，加培养基中和时要缓慢，以免破坏融合的细胞。,杂交瘤细胞的筛选,（第一次筛选）,5,、,阳性杂交瘤细胞,的筛选,（第二次筛选）,：筛选时机的把握,（,1,）免疫酶技术：,ELISA,应用最多。,（,2,）免疫荧光技术：,IFA,（,3,）间接血凝实验,（,4,）放射免疫检测,（,5,）免疫印迹分析,（,6,）免疫沉淀,（,7,）免疫组化和功能中和试验,重要思考：“你的抗体用于什么就用什么去筛”，筛选策略必须能够反映所需抗体随后的用途。,选择筛选策略时，必须要考虑下面的因素：,（,1,）能够处理多达,1000,个样品（约,120ul/,样品）的能力；,（,2,）,48h,内能够完成鉴定的能力；,（,3,）是否具备必要的试剂,/,设备；,（,4,）反应的特异性；,（,5,）实验体系的灵敏度；,（,6,）最重要的是否能得到结果。,筛选时融合前的免疫血清作为阳性对照，这样确保所有的技术、试剂、设备是最合适的。同样，用培养杂交瘤细胞的培养基作为阴性对照。,6,、,杂交瘤细胞的克隆化：,指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。,6.1,克隆化的原则：尽早进行，,一般要进行,2-3,次克隆。,6.3,克隆化的方法,主要包括以下：,克隆之前制备饲养细胞,6.2,（,1,）,有限稀释法,:,其原理是，将培养孔内细胞用枪或吸管吹打使之悬浮，然后用计数板进行计数，最后按每孔,0.5-1,个细胞的量将原孔细胞稀释滴至新的培养板上（事先制备好饲养层细胞），培养一段时间以后就可以看到部分孔有单个克隆形成（,理论上讲最终每孔的细胞个数在整体上服从泊松分布）,优点,:,a,、,最简单的克隆化方法,；,b,、,不需要太多的仪器设备，操作也不复杂。,缺点：,a,、,由于计数不准确或者移液器的偏差，最终导致操作结果不理想,；,b,、,由于细胞经过吹打的剪切力破坏，细胞也不一定能够按期望生长。,（,2,）,半固体培养法,:,原理,和做分子克隆时的菌落筛选有点类似半固体培养原理和做分子克隆时的菌落筛选有点类似,;,其,方法,是将杂交瘤细胞与液体低融点的琼脂糖或,甲基化纤维素,溶液混合，然后将其倒入含有事先制备的饲养层的培养板上，冷后后培养基呈固态，在,37,培养一段时间后，单个杂交瘤细胞会形成类似菌落的小克隆，可以用枪头将其挑出到培养板上在液体培养基里培养，这样也可以实现克隆化。,优点：,a,、,操作比较直观简单，,缺点：,对,半固体培养基的要求比较高，容易出现细胞不生长或者污染情况发生。,（,3,）,显微操作法,把阳性孔里的细胞稀释到足够稀，静置半小时后细胞会沉淀到孔底，然后在显微镜下用枪直接吸取一个单细胞转移到含有饲养层细胞的孔内培养即可。,优点：最初级、最直观、最省脑力和人力的办法，步骤简单。,（,4,）,荧光激活细胞分离法,：流式细胞术,7.,细胞的冻存和复苏,及时,对各阶段阳性杂交瘤细胞进行冻存,冻存步骤：,（,1,）吹下需冻存的细胞；,（,2,）,1000rpm,离心,5 min,，弃上清；,（,3,）用冻存液将细胞重悬，之后冻存；,（,4,）,将细胞放入,细胞冻存盒内,，然后将其直接放入,-80,冰箱,过夜（不小于,12h,），之后将细胞转入液氮中。,细胞复苏步骤：,（,1,）从液氮中取出细胞，,迅速,置于,37,水浴锅中融化细胞；,-,快！,（,2,）,直接将细胞加入瓶（,25cm,2,）中，并加入含,20%,胎牛血清的,DMEM,培养基贴壁培养,12,小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。,8.,单克隆抗体的生产,8.1,在产生特异性抗体的杂交瘤细胞分离、克隆并冻存建库后，扩增杂交瘤细胞可以生产抗体。处于对数生长期的杂交瘤细胞培养上清可产生,3-20ug/ml,的抗体。,-,抗体产量低,8.2,目前单克隆抗体生产包括,腹水制备和细胞培养,两种方法。,8.2.1,腹水制备流程：,（,1,）提前,7,天，小鼠腹腔注射,0.5ml,石蜡油；,（,2,）,小心吹打细胞瓶底部，使细胞从瓶底脱落,，收集细胞；,（,3,）室温,1200r/min,离心,6 min,，弃上清；,（,4,）用不完全培养液,DMEM,或生理盐水按照,0.5ml/,只鼠悬浮细胞；,（,5,）将细胞悬液注射到小鼠腹腔；,（,6,）,7-10,天后小鼠腹腔明显鼓起后，采集腹水。,8.2.2,细胞培养生产单抗：利用滚瓶、转瓶和,CELLine,瓶制备单抗。,（,1,）在单克隆抗体的产量方面，滚瓶和转瓶较一般的细胞培养瓶只有少许优势。,（,2,）,CELLine,：膜式双室技术的一种的体外细胞培养系统。,9,、单抗特性的检测：,9.1,抗体特异性：除用抗原进行抗体检测，还应用与抗原成分相关的其他抗原进行交叉实验，方法：,ELISA,等。,9.2,单克隆抗体亚类的鉴定,商品化试剂盒,9.3 Western Blot,分析,9.4,抗体的中和活性,9.5,抗体的亲和力,9.6,抗体对应抗原的分子量,9.7,抗体的识别表位,10.,抗体纯化,（,1,）初步纯化,盐析法,有机沉淀法,凝胶过滤法,（,2,）精细纯化,亲和层析法,离子交换层析法,疏水层析法,反向层析法,生物安全柜,II,级,A2,型生物安全柜最常用,生物安全水平与实验室类型,世界通用生物安全水平标准是由美国疾病控制中心,(CDC),和美国国家卫生研究院,(NIH),建立的。,级生物安全柜是一种负压过滤排风柜。,防止操作者和环境暴露于实验过程中产生的生物气溶胶。,（,1,）,保护实验操作者,在操作时，室内空气被抽入前面的格栅，产生一个空气屏障，防止有生物危险的悬浮微粒散入室内。,（,2,）保护实验样品,层流的、,HEPA,过滤的空气向下，通过工作面，防止室内空气进入，防止样品存在交叉污染。,（,3,）保护实验室环境,在空气离开柜前，必须通过一个排气,HEPA,滤膜，确保排出柜体的气流是洁净的，对环境无害。,细胞培养箱,倒置显微镜,含血清的,DMEM,96,孔细胞板,48,孔细胞板,24,孔细胞板,6,孔细胞板,存在问题及解决方案,1.,为什么免疫后没有效价或免疫后效价低？,（,1,） 设计的抗原与被免疫的动物内源蛋白有极高的同源性或者抗原是免疫原性极差的小分子物质。对于前一种情况应该重新设计抗原，设计抗原时尽量选取目标蛋白特异性的序列，可以设计为短肽然后再与载体蛋白偶联之后免疫；对于后一种情况，首先确认抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法；制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂、载体、抗原与载体的连接比例、 反应时间等多方面去考虑，并加以改进；如果偶联没有问题，可以更换其它的载体蛋白，如 KLH 。,（,2,） 免疫的周期不正确。免疫周期过长或过短，各免疫步骤之,间的间隔过长或过短都有可能影响免疫效果。,（,3,）免疫佐剂不合适。弗氏佐剂也不能保证完全有效，TiterMax 等佐剂在免疫时，对于某些抗原可能效果不佳，此时可以考虑更换佐剂尝试。,（,4,）,免疫剂量不合理。过大的免疫剂量可能导致免疫耐受，过少的免疫剂量可能无法激活免疫应答。,（,5,）,免疫途径不合理。,（,6,）,测效价的过程存在错误操作，尤其考虑包被是否成功或二抗使用是否正确。同时，一抗（即血清）稀释梯度尽量放宽，一般建议从1:500或1:1000开始作梯度稀释。对于多肽和小分子物质，效价达到1:2000甚至更低仍可视为免疫成功。,（,7,）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、,采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。,2.,为什么融合后细胞不长或者融合后克隆很少？,（,1,）,免疫用的动物品系不正确或者品系不纯。免疫用的动物一般应该与骨髓瘤来源的动物是相同品系，例如使用 SP2/0骨髓瘤细胞时应该选用 Balb/C 小鼠，同时必须使用品系纯正的小鼠。,（,2,）,培养基中加入了过高浓度的 HAT，或者仅 A 的浓度过高或 HT 的浓度过低，建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作 HAT 浓度筛选。,（,3,）,培养基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清。,（,4,）,未正确制备饲养细胞。,（,5,）,接种杂交瘤细胞的培养板过多。一般在5-20块96孔板为宜。,（,6,）,细胞被污染。在显微镜下仔细观察是否有明显的微生物污染。即使看不到有明显的微生物，也应该考虑是否有支原体污染，有条件的可以做支原体检测。,（,7,）,细胞培养条件不正确。确保细胞培养在恒定的37较湿的环境，同时保证 CO,2,浓度在4-5%左右。,（,8,）,其它与融合条件相关的不恰当的因素。,3.,为什么融合后得不到阳性克隆？,（,1,）,动物未免疫成功就进行了融合。,（,2,）,融合后得到的克隆较少，故得到阳性克隆的机率也较小。,（,3,）,筛选克隆手段不正确。例如有些小分子物质不可以直接包被到酶标板上，再如使用了不适当的二抗等诸多因素，也有人直接不使用 ELISA 作为筛选方法的，成功率也有待商榷。,（,4,）,抗原成份与细胞培养条件中的物质相同或类似,，,或者与筛选过程中有同抗 原结构相同或类似的物质产生了竞争反应。,如果需要制备抗 BSA 的单抗，则养杂交瘤的培养基中不可以使用牛血清，否则牛血清中的 BSA 直接与抗体相结合，最后做 ELISA 筛选的时候无法得到阳性结果。解决的办法只有使用其它的动物的血清或者使用无血清培养基。再如，如果需要制备酪蛋白的单抗，则做 ELISA 筛选时，二抗的稀释液不可以使用脱脂奶粉。,（,5,）,其它所有能影响 ELISA 等相关筛选手段的因素。,4,.,为什么细胞生长很慢？,（,1,）使用了劣质的培养耗材、培养基、血清、HAT 或 HT。建议新手使用知名厂商的试剂或耗材。对于血清，可能需要从多个厂家选用多个批次试用，选择出比较好的批次进行实验。在试用血清的时候，一般可以使用相对较低浓度的血清进行骨髓瘤细胞培养实验，根据骨髓瘤细胞的倍增速度确实血清质量。,（,2,）使用的血清或培养基浓度不正确。仔细检查配方是否正确。,（,3,）制备饲养细胞的方法不正确。,5.,克隆原来检测是阳性的，为什么后来转为阴性了？,首先要注意的是，正常情况下，杂交瘤也不是绝对稳定的，确实容易发生染色体丢失的情况，尤其是当细胞移到新环境中生长，如从小孔扩大到大孔，或者复苏操作时，更容易发生阳性变为阴性。,但是也有一些办法尽量减少阳性变为阴性，一般可以从这几个方面加以注意：,（,1,）,永远保证细胞处在最佳的生长环境中。,尤其是培养基不能长期不换，一般来说，当细胞增长到一定密度的时候，培养基就开始变颜色，这个时候就要准备换培养基了。除了换培养基，同时应该控制好细胞的密度，可以吹走过多的细胞，使新加入的培养基不至于很快被消耗。,（,2,）对于重要的细胞株，每一步都把阳性的细胞保种。,（,3,）不要过于频繁操作细胞。当细胞生长密度不是很大的时候，不要频繁操作，否则细胞容易出现死亡或者生长形态发生明显变化。,（,4,） 对于传代次数较多的细胞株需要经常进行亚克隆，并将每一次的亚克隆株也作冻存。,（,5,）当细胞被支原体等微生物污染，也会发生由阳性转为阴性的情况。,6.,为什么亚克隆后长不出克隆来？,（,1,）亚克隆时，原始孔里的细胞状态不好，经过有限稀释或其它手段亚克隆的细胞活性很差，以至于长不出克隆。,（,2,）亚克隆时，没有按照正确的数量取出细胞，亚克隆的过程服从泊松分布，如果取出的细胞远远低于平均每孔一个细胞，或有效细胞远远低于平均每孔一个细胞，则也可能出现长不出克隆的结果。,（,3,）未添加饲养细胞。单个细胞在完全培养基中极难培养，如果不添加饲养细胞，则它们很可能很快就死亡，最终就长不出克隆。,（,4,） 使用的 HAT 中 HT 失效或 A 的浓度过高，或者未添加 HT。 虽然 HT 对杂交瘤的生长并不是必须的，但是 HT 确实可以加快细胞生长，改善细胞生长状态。,（,5,）使用无血清培养基。这一点是很冷僻的一个因素。虽然很少有人使用无血清培养基制备单抗，但是在某些血清可能干预筛选步骤的实验的时候，可能会选用无血清培养基来培养杂交瘤，但是需要注意的是，在很多种无血清培养基中，单个细胞是很难长成克隆的。最好的解决办法就是先用含有血清的培养基培养它们，等克隆长出后再把培养基彻底更换为无血清培养基。,7.,为什么冻存的细胞很难复苏或者复苏不活？,这个问题要从两个方面来回答，一是冻存方面，二是复苏问题。,7.1,对于冻存过程，需要注意：,（,1,） 冻存液的配方。这个问题很关键，一个良好的冻存液配方可以使细胞保存得非常好，而一个不好的冻存液配方可能会让细胞倾刻死亡。冻存保护剂 DMSO的含量非常重要，如果这个浓度过低，则起不到保护作用，冻存的细胞最终会死于冰晶形成时的张力，如果浓度过高，则细胞中毒而亡。,（,2,）冻存过程中，不可用力过大，在冻存液中重悬细胞的时候更是要轻柔，因为在 DMSO 存在的条件下，细胞膜变得非常脆弱，如果用力过猛，则细胞膜很容易破，复苏成活的机会就明显会下降。,（,3,）冻存的程序也非常重要。实践表明，以每分钟1的速度下降冻存细胞是最理想的。,（,5,） 保证被冻存的细胞处于良好的生长状态，并且没有被污染。,（,4,）如果条件简易，可以把细胞放在4半小时左右，然后再在-20放置1小时，最后转入-80放置过夜，最终转入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80也行。现在有细胞冻存盒，把需要存放的细胞放进去，然后直接放-80就行，等时间够长后直接转至液氮中即可。,7.2,对于复苏过程，需要注意：,（,1,）,快速融化。为了防止升温中细胞内产生冰晶，强烈建议加快融化过程。一般都要用足够体积的 37热水复苏，并不断晃动冻存管。,（,2,）,复苏过程不要把冻存管全部泡入水中，也不要把盖子弄湿，否则热水有可能污染管口，造成复苏的细胞被污染。,（,3,） 如果复苏细胞时，没有去掉冻存液，这样就把冻存液里的DMSO 带到了新的培养体系里，容易对细胞造成毒害，所以对于贴壁细胞贴壁后换液或者细胞离心后去掉冻存液，然后用新的完全培养基重悬，再接种到新的容器内培养。,8.,单克隆抗体制备细胞实验最棘手的问题,-,细胞污染,细胞培养污染是指培养环境中侵入了对细胞生存有害的成分和造成细胞变异的异物。,细胞培养污染可分为以下三类: 物理性、化学性及生物性。,8.1,物理性污染的来源、危害及预防,物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分, 从而影响细胞的代谢。,（,1,）培养环境中的物理因素，如温度、放射线、振动、辐射( 紫外线或荧光) 会对细胞产生影响。,（,2,）细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中， 可以引起细胞代谢发生改变, 如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。,（,3,）,防范措施：,通过实验室的合理设计及建立规范的操作规程， 可以减少环境中物理因素对细胞的影响。培养箱应放在温度较恒定的环境中，周围不能放置能引起机械振动的设备，如离心机。培养液及培养试剂应放在固定的位置，为避免光照试剂不能放在玻璃门的冰箱中，试剂周围不能放同位素。培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实验，以避免过冷的温度对细胞的影响。,8.2,化学性污染的来源、危害及预防,培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。化学物质并不总是抑制细胞的生长， 某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。,未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。,细胞培养的必需养分，如氨基酸，若浓度超过了合适的范围，也会对细胞产生毒性。同样，不同细胞系其最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的，在培养中应严格控制。,玻璃制品清洗过程中残留的变性剂或肥皂( 通常残留在瓶盖的内表面) 是最常见的化学性污染。,8.2.1,水,水是唯一一种在凝固时膨胀的化合物。因此在选择冻存细胞的容器时应考虑到这个因素。容器因水的膨胀而发生破裂是引起试剂污染的重要原因。为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水。需要注意的是, 超纯水放置过久其纯度会下降。,在高压蒸气灭菌及蒸馏水时水经常被污染， 因为高压蒸气锅及纯水机的常规维护后可能有少量的化学物质残留。为了保证水的纯度, 我们应采取措施尽量避免化学物质的残留。,8.2.2,血清,动物血清是细胞培养中常用的天然培养基, 但血清又是潜在的生物及化学污染的来源。,由于血清采集于多个动物, 而且不同厂商的生产工艺及质量各不相同, 因此血清中许多成分的浓度存在很大的变异。血清对不同细胞的促生长能力及毒副作用取决于这些细胞的分化功能、组织来源及培,养基的成分等因素。在进行一系列实验时, 为了保证实验的可重复性,最好选用同一批次的血清。,8.3.3,培养液、培养附加成分、试剂,培养液、培养附加成分、试剂都可能成为化学性污染的来源。细胞培养使用的所有物质都应是高纯度的，并经过权威机构的鉴定，实验者本人也应对上述成分进行纯度鉴定。同时, 正确配置和储存培养液及试剂也非常重要的, 应该采取标准的操作步骤，避免液体体积计算错误, 混用类似化合物等错误。,8.3.4,培养器皿及容器,细胞培养过程中会使用到各种不同的培养器皿及容器。培养器皿的大小,构形设计可能会影响到培养中气体交换、湿度、培养液的 pH 值和细胞生长密度。培养器皿的工艺及灭菌过程中的差异可能对培养体系产生影响。塑料制品在生产过程中可能残留一些有毒成形剂，生产工艺的不同可能引起器皿表面附着能力的不同。储存不同物质时应选用合适的塑料或玻璃容器，因为酒精、强酸、强碱能够溶解塑料或玻璃的某些成分。,8.3,生物性污染的来源、危害及预防,外界的微生物如昆虫、节肢动物、原虫、霉菌、病毒、细菌、无细胞壁的微生物( 通常指支原体) 和其它类型的细胞都可能侵入培养环境引起污染。只要在一个开放的环境中进行培养, 都难以避免发生污染。,8.3.1,细菌污染,􀂾细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素,(,一般为预防剂量,),，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。,􀂾培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，,pH,改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株,(,系,),丢失。,8.3.2,真菌污染,􀂾真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。,􀂾培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。,8.3.3,支原体污染,􀂾,支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径,0.2,m,，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件,(pH7.6,8.0),下生存，对青霉素有抗药性，多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。,􀂾培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。,8.3.4,病毒污染,􀂾,采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于,20,种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有,SV40,或多发瘤病毒，,B,淋巴细胞含,EB,病毒，细胞和会发生变异、转化，形成异倍体的细胞系。因此潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。,8.3.5,非同种细胞污染,􀂾由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物，,ERK/KD,细胞是从兔肾中分离出来的，而现在句却认为是,HeLa,细胞。目前，世界上已有几十种细胞都被,HeLa,细胞所污染，致使许多实验宣告无效。,􀂾非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。,预防措施：,（,1,）在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好做上标记便 于辨别。并按顺序进行操作，避免一起进行时易发生混乱。,（,2,）在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以 免把细胞带到培养液中污染其他细胞。,（,3,）所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，均应及早留种冻存，一 旦发生污染可弃之复苏，重新培养。,9.,单克隆抗体面临的问题,9.1,如何进一步缩短单抗研发周期,降低生产成本,传统方法制备单克隆抗体包括抗原制备、动物免疫、抗体检测方法的建立、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、亚克隆、冻存复苏、杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定及单克隆抗体的大量生产等一系列复杂步骤，一般要花费,6,个月以上的时间，研发周期较长。同时每只小鼠自始自终只能免疫一种纯化抗原，将这种免疫小鼠的脾脏,B,淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合后，形成的杂交瘤细胞也只能分泌针对这一种纯化抗原的单一单克隆抗体，工作效率低,生产成本高。因此，如何利用分子生物学技术，克服现有生产技术的局限性,缩短单抗研发周期，降低生产成本，建立生产杂交瘤细胞株的高效方法，是当前需 解决的问题。,9.2,如何进一步提高体外用单抗的品质,研制高亲和性单抗是免疫化学技术的重要发展方向之一，将会进一步提高单克隆抗体在微量分析领域内的应用。同时，随着单抗在诊断与治疗中应用的快速发展，对单抗种类及数量的需求越来越多,如何进行大规模的生产也已成为抗体纯化的主要问题。另外，单克隆抗体对抗原的识别,与多克隆抗体有很大的不同。不同试剂盒因使用的单克隆抗体不同,识别抗原的位点不同，导致检测结果有一定差异。因此,体外用单抗标准化问题还需要进一步研究。,9.3,如何进一步提高治疗用单抗的品质,如何进一步降低单抗药物的免疫原性，提高单抗药物在肿瘤组织的浓度是研制治疗用单抗的发展方向。,一、鼠源性单克隆抗体,发展历程,二、人源化抗体,1.,概念：是指抗体的可变区部分（即,Vh,和,Vl,区）或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。,2.,人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体、表面重塑 抗体和全人源化抗体等。,2.1,嵌合抗体,（,1,）概念：是利用,DNA,重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体，这样表达的抗体分子中轻重链的,V,区是异源的，而,C,区是人源的，这样整个抗体分子的近,2/3,部分都是人源的。,（,2,）特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性；保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。,2.2,改型抗体,（,1,）概念：改型抗体也称,CDR,植入抗体,(CDR grafting antibody),，抗体可变区的,CDR,是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性。将鼠源单抗的,CDR,移植至人源抗体可变区，替代人源抗体,CDR,，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。,2.3,表面重塑抗体,（,1,）概念：表面重塑抗体是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体,SAR,差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。,2.4,全人源化抗体,（,1,）概念：是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。,三 、小分子抗体,完整抗体分子具有体积大（相对分子质量约为,15010,3,）、组织穿透能力差等不足，促进了抗体分子的小型化。小分子抗体具有组织穿透能力强、免疫原性弱、结构稳定、制备简单和表达效率高等优点，是基因工程中制备人源单抗的主要产物，目前小分子抗体主要用于放射免疫显像或治疗等方面。其缺点是与抗原的结合力弱、半衰期短等。,小分子抗体主要包括：单价小分子抗体，如,Fab,片段、,Fv,片段最小识别单位等；多价小分子抗体，如双链、三链抗体等；纳米抗体，即只有一个重链可变区组成的单域抗体，其相对分子质量只有单克隆抗体的,1/10,，是最小的具有完整功能的抗原结合片段。,实际应用,单克隆抗体被广泛应用于农业、医学及其他生物领域，并发挥越来越重要的作用。,1.,检测微生物,1.1,检测特异的病毒,单克隆抗体具有高灵敏性和高特异性,在鉴定菌种和病毒等的群特异性、种特异性、型和亚型特异性,乃至株特异性方面独具优势,且能鉴定寄生虫不,同生活周期的抗原性,常用于疫病检疫、诊断、免疫监测和流行病学调查等。,（,1,）植物病毒单克隆抗体的研制主要应用于植物病毒和病害检测及株系鉴别。,（,2,）在动物病毒单克隆抗体的研制方面，用于疫病诊断。,1.2,鉴定细菌种类及亚型,或测其耐药性,1.3,检测寄生虫或其他病原体,冯秀丽等,(2007),用提取的禽致病性大肠杆菌,1,型菌毛免疫,BALB/c,小鼠制备单克隆抗体,对,46,株带有,1,型菌毛的禽致病性大肠杆菌优势血清型分离株进行检测表明，该单克隆抗体都能与之发生特异性反应。王崇义等,(2006),用单克隆抗体标记乳胶凝集试验快速检测金黄色葡萄球菌及其耐药性，具有较高灵敏度和特异性。,陈心春等,(2007),将人隐孢子虫超粉碎后,免疫,BALB/c,小鼠制备单克隆抗体，经流式细胞术检测其反应性表明，该单抗对隐孢子虫胞内和胞外的检测无差异。孙晓林等,(2008),将纯化的猪带绦虫六钩蚴,45W-4BX,重组抗原免疫,BALB/c,小鼠制备单克隆抗体，结果表明所获单抗能满足常规试验的要求，可用于带绦虫六钩蚴,45W-4BX,抗原的组织定位。,2.,检测微量成分,用单克隆抗体进行酶标免疫测定或结合同位素进行放射免疫分析，可用于检测体液内微量成分,(,如激素,),的含量，用以判断机体内分泌功能状态是否正常或判断前期治疗效果；也可用于快速检测瓜果蔬菜、食品等农产品的农药残留,外环境水体的农药污染情况，及保证对公共卫生应急事件的检测。,2.1,检测机体内微量成分,如 检测,-,干扰素,2.2,检测药物残留,3.,确定免疫机制,分析抗原结构,定位病原组织,单克隆抗体由于其与抗原结合的特异性及检测过程中逐级放大的特点，可以精确定位和定量抗原,是免疫学和血清学研究的重要工具,被广泛用于酶联免疫吸附试验（,ELISA,）、流式活化细胞分选仪,(FCS),、免疫印迹和免疫组化研究中，其灵敏度可达到微克,(,g),水平，可利用它更全面、更细微地分析抗原结构,特别是分析细胞表面的小分子抗原，对分析体内免疫反应机制、判断机体免疫水平和免疫调节平衡状态具有重要的实际意义。,4.,在肿瘤诊疗中的应用,（,1,）在医学诊断方面,单克隆抗体可用于肿瘤的诊断、分型和定位；可区分不同细胞的亚群和分化阶段，了解细胞的来源、分布和功能，以制定有效的治疗方案；可用于主要组织相容性抗原,HLA,系统的分型和,ABO,等血型的鉴定。,（,2,）在临床治疗方面,单克隆抗体可作为被动免疫而用于治疗；也可作为载体与各种类型的细胞毒制剂结合，直接导向定位于肿瘤细胞以提高抗体的疗效，降低细胞毒制剂的非特异性毒性反应；同时,单克隆抗体还可作为预防手段，用于骨髓移植和器官移植,以预防或治疗移植物抗宿主病,(GVHD),、排斥反应及肿瘤细胞的致病作用。,5.,用于蛋白质的提纯,单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质上，并制备成层析柱，当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或,pH,，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液，便可得到欲纯化的抗原。,Thank you for your time and attention,！,