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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定,教学内容,一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三,1,一、蛋白质的酸碱性质,一、蛋白质的酸碱性质,2,对某种蛋白质来说，在某一,pH,，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一,pH,，蛋白质的,等电点。,蛋白质的等电点,有中性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。如,Ca,2+,、,Mg,2+,、,Cl,-,、等可与蛋白质某些可解离基团结合，影响等电点。,无盐类干扰时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液,pH,称为等离子点,(isoionic point,或称等离点,),。等离子点是每种蛋白质的一个特征常数。,对某种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷与负电荷恰好相等,3,一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定,教学内容,一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三,4,二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀,(,一,),蛋白质胶体性质,(,二,),蛋白质沉淀,二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀(一) 蛋白质胶体性质,5,分散相质点在,1,l00 nm,范围内,在动力学上是稳定的,介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零,使它能在介质中作不断的布朗运动,;,分散相质点带有同种符号的净电荷,互相排斥,不易聚集成大颗粒而沉淀,;,分散相质点能与溶剂形成溶剂化层,例如与水形成,水化层,质点有了水化层,相互间不易靠拢而聚集,.,(,一,),蛋白质胶体性质,分散相质点在胶体系统中保持稳定的,3,个条件,:,蛋白质溶液,稳定的,亲水胶体,:,亲水基团与水发生,水化作用；,某一,pH,下相同电荷。也有丁大尔现象、布朗运动以及不能透过半透膜性质,分散相质点在1l00 nm范围内, 在动力学上是稳定的,6,蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关,影响这些条件的因素都会影响蛋白质溶液的稳定性：加人,脱水剂,以除去它的水化层；改变溶液的,pH,达到蛋白质等电点使质点的净电荷为零，蛋白质分子则聚集成大的颗粒而沉淀。,(,二,),蛋白质沉淀,蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关, 影响这些,7,沉淀蛋白质的方法有以下几种,:,盐析法：中性盐,(,硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等,),，脱去水化层而聚集沉淀，蛋白质不变性。,有机溶剂沉淀法：脱去水化层、降低介电常数增加异性电荷间的相互作用，蛋白质变性。低温操作，且尽量缩短处理时间则可使变性速度减慢。,重金属盐沉淀法：带负电荷时易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。可口服大量牛奶或豆浆等可解重金属盐中毒。,生物碱试剂和某些酸沉淀法：,蛋白质带正电合适与之结合沉淀。,加热变性沉淀法：加热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加热凝固,沉淀蛋白质的方法有以下几种:盐析法：中性盐(硫酸铵、硫酸钠或,8,一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定,教学内容,一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三,9,三、蛋白质,分离纯化,的一般原则,(1),前处理,:,(2),粗分级分离,:,(3),细分级分离,:,蛋白质纯化测总目标：增加,纯度或比活力,三、蛋白质分离纯化的一般原则(1)前处理: 蛋白质纯化测总目,10,动物材料剔除结缔组织、脂肪组织,;,种子材料应先去壳和种皮以免受单宁等物质的污染,油料种子脱脂,.,选择适当方法,破碎组织或细胞：动物组织,(,电动捣碎机或匀浆器或超声,);,植物组织,(,英砂或玻璃粉和适当的缓冲液研磨或用,纤维素酶,);,细菌细胞,(,超声,与砂研磨或,溶菌酶,).,选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来,.,如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的,用超声波或去污剂使膜结构解聚,用适当的介质提取。,(1),前处理,:,动物材料剔除结缔组织、脂肪组织; 种子材料应先去壳和种皮以免,11,(2),粗分级分离,:,常用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，有时可用超过滤或凝胶过滤等方法。,(3),细分级分离,:,各种层析、电泳巧妙配合,后期可 用结晶法。,(2)粗分级分离:,12,一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定,教学内容,一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三,13,四、蛋白质的分离纯化方法,根据分子大小不同,利用溶解度差别,根据电荷不同,利用选择性吸附,利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法,(,一,),透析和超过滤,(,二,),凝胶过滤,(,三,),盐溶和盐析,(,四,),有机溶剂分级分离法,(,五,),凝胶电泳和等电聚焦,(,六,),离子交换层析,(,七,),亲和层析,(,八,),高效液相层析,四、蛋白质的分离纯化方法根据分子大小不同(一) 透析和超过滤,14,常用凝胶：交联葡聚糖、,聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖（,sepharose,或,Bio-Gel A,）；,凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外，即分,级分离范围或排阻极限,;,大分子从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小。小分子在颗粒网状结构洗脱历程长，后洗脱下来，洗脱体积大；,用洗脱体积同标准分子量的蛋白质的比例关系测定蛋白质分子量；,(,二,),凝胶过滤,凝胶过滤层析、大小排阻层析或凝胶渗透层析,常用凝胶：交联葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖（sepharo,15,V,t,:,柱床总体积，常称,柱床体积；,V,0,：为孔隙体积或,外水体积,，测出不被凝胶滞留的蓝色葡聚糖,-2000,的洗脱体积即为,V,0,;,V,i,：,内水体积,，凝胶珠内部的水相体积；,V,m,：为凝胶基质体积；,V,t,=,V,0,+,V,i,+,V,m,V,e,某一待分离物质组分的洗脱体积,自加样品开始到该组分的洗脱峰,(,峰顶,),出现时所流出的体积；,各组分的流出顺序，可用分配系数,K,d,来量度：,K,d,=(,V,e,V,o,)/,V,i,。,几个要说明的问题,V,0,V,t,V,0,V,t,K,d,：组分分子大小的函数；,完全排阻的大分子：,V,e,=,V,0,，,K,d,=0;,完全进入凝胶珠的小分子：,V,e,=,V,0,+,V,i,，,K,d,=1;,其他的：,K,d,在,0,和,1,之间,;,K,d,大于,1,：凝胶对组分有吸附,Vt: 柱床总体积，常称柱床体积；几个要说明的问题 V0,16,几个要说明的问题,V,0,V,t,V,0,V,t,K,d,：组分分子大小的函数；,完全排阻的大分子：,V,e,=,V,0,，,K,d,=0;,完全进入凝胶珠的小分子：,V,e,=,V,0,+,V,i,，,K,d,=1;,其他的：,K,d,在,0,和,1,之间,;,K,d,大于,1,：凝胶对组分有吸附,测得几种标准蛋白质的洗脱体积,Ve,以相对分子质量对数,(logM),对,Ve,作图，得标准曲线，再测出未知样品洗脱体积,Ve,，从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量,.,几个要说明的问题 V0 VtV,17,(,三,),盐溶和盐析,盐溶：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为,盐溶,；,盐析,:,当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为,盐析,;,同一浓度盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。,盐溶原理,:,蛋白质吸附某种盐离子后彼此排斥。,盐析原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从溶液中析出,(三)盐溶和盐析盐溶：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度,18,(,四,),有机溶剂分级分离法,降低水溶液的介电常数，破坏大分子周围水膜，使溶质溶解度降低,;,利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮；,易使蛋白质和酶变性，操作必须在低温条件下进行,.,(四)有机溶剂分级分离法降低水溶液的介电常数，破坏大分子周围,19,电泳：在外电场的作用下,带电颗粒,例如带电的蛋白质分子,将向着与其电荷符号相反的电极移动,这种现象称为,电泳,(electrophoresis),或离子泳,(ionophoresis),。,(,五,),凝胶电泳和等电聚焦,Sample,Well,Direction of,migration,电泳：在外电场的作用下,带电颗粒,例如带电的蛋白质分子,将向,20,带电颗粒在电场中泳动时,受到两种方向相反的作用力,:,q,：,颗粒所带电量；,E,：电场强度,U/d,；,U,：两电极间的电势差,(V),；,d,：两电极间距离,(cm),；,f,摩擦系数；,v,：泳动速度,(cm /s),；当颗粒以恒稳速度移动时,则,F,F,f,= 0,在一定介质中对某一蛋白质来说，,q,/,f,是一定值，因而,v/E,也是定值，它被称为,电泳迁移率或泳动度,:,=,v/E,电泳原理：,带电颗粒在电场中泳动时,受到两种方向相反的作用力:q： 颗粒,21,A stable pH gradient is established in the gel after application of an electric field.,Protein solution is added and electric field is reapplied.,After staining, proteins are shown to be distributed along pH gradient according to their pI values.,等电聚焦,(IEF),pH,梯度制作：利用两性电解质,(,商品名,: Ampholine),，,多氨基多羧酸系列两性化合物,同系物,的复杂混合物,，它们有相近但不同的,pH,和,pI,值，在电场作用下，自然形成,pH,梯度,.,A stable pH gradient is establ,22,First dimension,Isoelectric focusing,Isoelectric focusing gel is placed on SDS,polyacrylamide gel.,Second dimension,SDS polyacrylamide,gel electrophoresis,双向电泳,(Two-dimensional electrophoresis),First dimensionIsoelectric foc,23,利用蛋白质分子对其配体,(,或称为配基,),分子特有的识别能力建立起来的纯化方法,.,将特异配体共价地连接到像琼脂糖凝胶这类载体表面的官能团,(,如,-OH),上，配体和多糖载体之间插人一段长度适当的连接臂,(,如,-,氨基己酸,),，使配体与凝胶之间保持足够的距离，不致因载体表面的位阻妨碍待分离的分子与配体结合,.,这类载体在其他性能方面允许蛋白质能自由通过,.,(,七,),亲和层析,(affinity chromatography),洗涤除去,琼脂糖凝胶珠,配体分子,杂蛋白分子,(,不被吸附,),连接臂,被吸附的蛋白质分子,亲和洗脱,亲和层析的原理,利用蛋白质分子对其配体(或称为配基)分子特有的识别能力建立起,24,是离子交换层析、凝胶过滤、吸附层析和分配层析等技术的新发展,.,对柱层析来说,固相载体的颗粒愈小、分辨率愈高,但是洗脱液的流速也愈慢。采取高压和机械性能强、化学性能稳定、颗粒度细小而均匀的载体和其他设备自动完成分离纯化,.,HPLC,可用于蛋白质、氨基酸及其他生物分子的分析和制备。,(,八,),高效液相层析,(high performance liquid chromatography, HPLC),溶剂过滤器,溶剂储存器,泵,检测仪,记录仪,收集器,恒温装置,层析柱,进样室,是离子交换层析、凝胶过滤、吸附层析和分配层析等技术的新发展.,25,一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定,教学内容,一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三,26,五、蛋白质相对分子质量的测定,(,一,),凝胶过滤法测定相对分子质量,(,二,) SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量,(,三,),沉降速度法测定相对分子质量,五、蛋白质相对分子质量的测定(一) 凝胶过滤法测定相对分子质,27,蛋白质过凝胶柱速度直接取决于它的斯托克半径。如某种蛋白质与一理想的非水化球体具相同过柱速度即相同的洗脱体积，则这种蛋白质具与此球体相同的半径，称,斯托克半径。,标准蛋白质,(,已知,Mr,和斯托克半径,),和待测蛋白质须有相同分子形状,(,接近球体,),否则不能得到比较准确的,Mr.,一般用交联葡聚糖,（,Sephadex,）,Sephadex G-75(分级分离的M,r,范围3 00080 000)或G,-,100(M,范围4000150 000),.,(,一,),凝胶过滤法测定相对分子质量,1966, Andrews,提出个经验公式,:,蛋白质过凝胶柱速度直接取决于它的斯托克半径。如某种蛋白质与一,28,（二）,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量,SDS,破坏蛋白氢键和疏水相互作用,巯基乙醇能打开二硫键, SDS,和巯基乙醇存在下,单体蛋白或亚基,(,寡聚蛋白质解离成亚基,),处展开状态,.,SDS,烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体,.,在一定条件下, SDS,与大多数蛋白质的结合比,: 1.4g SDS / 1 g,蛋白质,相当于每两分子氨基酸残基结合一分子,SDS.,SDS,与蛋白质结合后,:,第一, SDS,阴离子使多肽链覆盖上相同密度的负电荷,远超过蛋白质原有电荷量,掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别,;,第二,改变蛋白质的天然构象,使大多数蛋白质采取类似的形状,.,因此在,SDS,存在下的电泳几乎是完全基于相对分子质量分离蛋白质的,.,（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量SDS破坏蛋,29,（二）,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量,SDS-PAGE,，迁移率不受蛋白质原有的电荷、分子形状等因素影响,但凝胶具分子筛效应,.,因此，迁移率与相对分子质量,(Mr),之关系,:,常数,相对迁移率：样品迁移距离,/,前沿,(,染料,),（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量SDS-PA,30,（三）沉降速度法测定相对分子质量,直接测定蛋白质,Mr,的方法：渗透压法、光散射法、沉降速度法、沉降平衡法和黏度法等，沉降速度法是经典的常用方法,.,超速离心机最大转速,: 60000,80 000r/min,相当于位于距转轴中心,10 cm,处、单位质量,(1g),分子所受到的离心力,(,离心场强度,),为,400 000 g,700 000 g.,沉降速度与蛋白质分子大小、密度和形状有关,且与溶剂密度和黏度有关,.,单位离心场强度的沉降速度称为,沉降系数,用,s(,小写,),表示,:,从轴心到沉降界面的径向距离,(cm),时间,离心角速度,(rad/s):,转速,(r/min),2,/ 60,（三）沉降速度法测定相对分子质量直接测定蛋白质Mr的方法：渗,31,（三）沉降速度法测定相对分子质量,蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数：,1,10,-13,200,10,-13,秒范围,.,把,l0,-13,s,作为一个单位,斯维得贝格单位,(Svedberg unit),或称,沉降系数单位,用,S(,大写,),表示,.,例如人血红蛋白,: 4.46S,即,4.46,10,-13,s,。,蛋白质的沉降系数,(s),与相对分子质量,(Mr),的关系可用斯维得贝格方程表达,:,摩尔气体常数,(8.314JK,-1,mol,-1,);,热力学温度,(K),旧称绝对温度,蛋白质的扩散系数,(cm,2,/s),数值上等于当浓度梯度为,1,个单位时在,1 s,内通过,1 cm,2,面积的蛋白质质量,溶剂的密度,(g/cm,3,),偏微比体积,(cm3/g),又称偏微比容,蛋白质溶于水的偏微比容约,0.74 cm,3,/g,沉降系数,（三）沉降速度法测定相对分子质量蛋白质、核酸、核糖体和病毒等,32,六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定,常用电泳法,(IEE,、,PAGE,和,SDS-PAGE),、,HPLC,法、免疫学方法等,.,此外,N-,末端分析,也用于纯度鉴定,(,一,),蛋白质含量测定,凯氏定氮法：已不多用,Folin-,酚试剂法,(Lowry,法,):,基于,Cu,2+,Cu,+,双缩脲法,紫外吸收法,:,精确度不高,操作简便,样品可回收,适用于核酸测定,染料结合法,(Bradfold,法,):,考马斯亮蓝,G-250,结合法,灵敏度高,(1,g),BCA,法,:,新开发的,碱性条件, 4,4,-,二羧,-2,2,-,二醌,(CBA),与,Cu,+,形成紫色复合物,反应比,Folin-,酚试剂更强,生物活性测定法,:,利用酶或激素特有的活性测定,抗原,-,抗体法,:,没特异生物学活性的蛋白,注入动物体内产生抗体,利用抗原,-,抗体反应测定蛋白含量,生物学活性测定和总蛋白量测定配合,:,鉴定纯化程度,(,比活力,),(,二,),蛋白质纯度鉴定,六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定常用电泳法(IEE、PAGE和,33,基本要求,掌握蛋白质的酸碱性质。,掌握测定蛋白质相对分子质量的常用方法。,掌握蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀的方法和原理。,掌握蛋白质分离纯化的一般原则。,熟悉蛋白质分离纯化的常用方法。,掌握蛋白质含量测定与纯度鉴定的常用方法。,作业题：第,1,、,2,、,3,、,8,、,9,、,10,题,基本要求掌握蛋白质的酸碱性质。作业题：第1、2、3、8、9、,34,
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