肺炎链球菌的分离和鉴定课件

,单击此处编辑母版标题样式,精选课件,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,精选课件,*,肺炎链球菌的分离和鉴定,精选课件,1,肺炎链球菌的分离和鉴定精选课件1,概 述,肺炎链球菌,（,S.pneumoniae,），俗称肺炎球菌（,pneumococcus,）。经常寄居于正常人的鼻咽腔中，一般不致病，只形成带菌状态。当机体免疫力下降时才致病。尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、老年体弱者易发生肺炎链球菌性肺部感染。,精选课件,2,概 述 肺炎链球菌（S.pneumoni,肺炎链球菌不产生外毒素，主要靠,荚膜,侵袭力致病。肺炎链球菌主要引起人类,大叶性肺炎,，肺炎后可,继发,胸膜炎、脓胸，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻窦炎、支气管炎、心内膜炎、腹膜炎、关节炎、脑膜炎和败血症等。,精选课件,3,肺炎链球菌不产生外毒素，主要靠荚膜侵,细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值，同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。,精选课件,4,精选课件4,一、生物学性状,精选课件,5,一、生物学性状精选课件5,1.,形态与染色,肺炎链球菌革兰染色呈阳性。球形或矛头状，成双排列，少呈链状。在组织中可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失），无鞭毛及芽孢。,精选课件,6,1. 形态与染色肺炎链球菌革兰染色呈阳性。球形或矛头状，成双,精选课件,7,精选课件7,精选课件,8,精选课件8,精选课件,9,精选课件9,2.,培养特点,（,1,） 培养基,肺炎链球菌对营养要求较高，需采用质量好的,哥伦比亚琼脂,基础和,新鲜血液,（,5,马血或羊血） 。,琼脂浓度可适当下降至,1,1.2,，有利于肺炎链球菌的生长。,精选课件,10,2. 培养特点（1） 培养基精选课件10,（,2,）分离培养,1,）标本处理,及时,将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。因为，肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致,分离率低,的主要原因。,精选课件,11,（2）分离培养1）标本处理精选课件11,2,）选择性分离培养基,培养基中添加,5,g/ml,庆大霉素,有利于肺炎链球菌的分离。,精选课件,12,2）选择性分离培养基培养基中添加5g/ml庆大霉素有利于肺,3,） 培养环境,5,10,CO,2,、,35,培养,24,48h,。,精选课件,13,3） 培养环境 精选课件13,（,3,）肺炎链球菌的菌落形态,在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形成,扁平,、,中间有凹陷,的典型菌落，少数菌可呈,粘液型,菌落。,精选课件,14,（3）肺炎链球菌的菌落形态在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形,精选课件,15,精选课件15,精选课件,16,精选课件16,精选课件,17,精选课件17,肺炎链球菌,精选课件,18,肺炎链球菌精选课件18,肺炎链球菌,精选课件,19,肺炎链球菌精选课件19,精选课件,20,精选课件20,肺炎链球菌,精选课件,21,肺炎链球菌精选课件21,3.,抗原结构,（,1,）种属特异性抗原：,为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。,（,2,）型特异性抗原：,是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为,、,、,等个型，其中,、,、,型致病性最强。,（,3,）菌体核蛋白抗原：,存在于菌体深部，为蛋白质，无特异性。,精选课件,22,3.抗原结构（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎,二、肺炎链球菌鉴定,肺炎链球菌的鉴定，主要应,与甲型溶血性链球菌鉴别,。其中以,胆汁溶菌,试验、,菊糖发酵,和,optochin,试验最为常用。必要时可作小鼠毒力试验加以鉴别。在上述试验中，肺炎链球菌均应阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。必要时可用特异性单克隆乳胶或自动化仪器等相应鉴定卡作鉴定。,精选课件,23,二、肺炎链球菌鉴定肺炎链球菌的鉴定，主要应与甲型溶血性链球菌,肺 炎 链 球 菌 鉴 定 要 点,革 兰 阳 性 双 球 菌， 矛 头 状，,不 呈 链,；,血 平 皿 菌 落 呈 草 绿 溶 血， 湿 润， 菌,落 表 面,无 小 白 点,；,培 养 时 间 长 出 现,脐 窝 状,；,胆汁溶解试验,阳性,；,乳 胶 单 克 隆 抗 体 凝 集,阳 性,。,精选课件,24,肺 炎 链 球 菌 鉴 定 要 点 革 兰 阳 性 双 球,口腔链球菌,精选课件,25,口腔链球菌精选课件25,精选课件,26,精选课件26,1.,溶血性检查,肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大加强，,草绿色溶血环很大,，可与其他草绿色链球菌相区别。,精选课件,27,1. 溶血性检查肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大,2. Optochin(OP),敏感试验,optochin,即乙基氢化叩卟啉，因结构似于奎宁，故又称为乙基氢化羟基奎宁。该药对肺炎链球菌的作用机制是干扰其叶酸的合成。,optochin,敏感试验方法似药敏试验。挑取被检菌，密涂于血平板上，贴上含,5,g/,片的,optochin,纸片，置,510%CO,2,的大气中（或烛缸），,35,孵育,过夜。抑菌环直径,=14mm,为敏感，推断为肺炎链球菌。抑菌环直径,=14mm,。应注意鉴别。,但大多数肺炎链球菌对苯唑西林（,Oxacillin,OX,）是敏感的,(,除外,PRP),，而缓症链球菌和口腔链球菌对,OX,耐药。这可作为,辅助鉴别,点。,精选课件,29,也有例外，我们在实际工作中检出过耐optochin的肺炎链,精选课件,30,精选课件30,肺炎链球菌,精选课件,31,肺炎链球菌精选课件31,肺炎链球菌,精选课件,32,肺炎链球菌精选课件32,精选课件,33,精选课件33,精选课件,34,精选课件34,3.,胆汁溶菌试验,自溶酶,是一种,L-,丙氨酸,-,N-,乙酰胞壁酰胺,酶，能切断肽聚糖上,L-,丙氨酸,与,N-,乙酰胞壁酸,间的连接键，从而破坏细胞壁，使菌溶解。,自溶酶在菌生长的稳定期,被激活,，也可被胆汁或胆盐等活性物质激活，从而促进培养物中的菌体溶解。肺炎链球菌胆汁溶菌试验为阳性，甲型溶血性链球菌的胆汁溶菌试验为阴性。,精选课件,35,3. 胆汁溶菌试验 自溶酶是一种L-丙氨酸,（,1,）试管法,:,取新鲜培养物分装于两支试管内（每支,1ml,），其中一支加入,10%,的,去氧胆酸钠,溶液,0.1ml,或纯牛胆汁,0.2ml,，另一支加入无菌盐水两滴（对照），,15min,后，阳性者细菌被溶解，试管内液体呈透明状，阴性者无变化。,精选课件,36,（1）试管法: 精选课件36,精选课件,37,精选课件37,（,2,）平皿法,:,加一滴,10%,的,去氧胆酸钠,溶液或纯牛胆汁于被检菌菌苔上，,15min,后，阳性者细菌菌苔被溶解，阴性者无变化。试验应有已知肺炎链球菌作阳性对照。,精选课件,38,（2）平皿法: 精选课件38,精选课件,39,精选课件39,精选课件,40,精选课件40,胆溶阴性,精选课件,41,胆溶阴性精选课件41,4.,乳胶凝集试验,结果准确、快速、特异性高。,精选课件,42,4.乳胶凝集试验 结果准确、快速、特异性高。精选课件42,精选课件,43,精选课件43,精选课件,44,精选课件44,5.,荚膜肿胀试验,取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀，加少量美蓝液混合后加盖片，室温,1020min,后，用油镜检查，如查到菌体呈兰色，周围绕有界限明显未染色的膨大空白圈为阳性。可用于肺炎链球菌的分型。,精选课件,45,5. 荚膜肿胀试验 取一滴抗血清与一滴菌悬液混,6.,凝集试验,包括血清凝集试验、,SPA,（葡萄球菌蛋白,A,）协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。,精选课件,46,6. 凝集试验精选课件46,表,1,非,溶血链球菌的鉴别,菌 种,Optochin,胆汁 胆 汁,6.5%NaCl,吡咯烷 卫星现象,CAMP,血清群,敏 感 溶菌 七叶苷 肉汤 酮 酶,肺炎链球菌,+ +, ,牛链球菌, + D,无乳链球菌, d + B,草绿色链球菌, ,营养变异链球菌, + + ,*d.,不同菌株,精选课件,47,表1 非溶血链球菌的鉴别精选课件47,三、肺炎链球菌的药敏试验,K-B,法：,采用,Mueller-Hinton,琼脂,5,羊血培养基。直接菌落悬液法,(0.5,麦氏单位菌液，在,15,分钟内接种完,),作为接种液。,稀释法：,包括琼脂稀释法、肉汤稀释法和,Etest,法。,培养条件：,为,35,、,5,CO,2,培养,20,24,小时。质控菌株,ATCC 49619,。,精选课件,48,三、肺炎链球菌的药敏试验 K-B法：采用Mueller-Hi,1.,肺炎链球菌的耐药机制,青霉素,G,耐药肺炎链球菌,（,PRP,）,的耐药机制是肺炎链球菌有,6,种青霉素结合蛋白,（,PBP,）,发生改变，因为,PBP1a/1b,和,PBP2a/2x/2b,是,-,内酰胺类抗生素的,作用靶位,，改变后使,PBP,与青霉素,G,的,结合力,下降；,青霉素,G,耐药肺炎链球菌,（,PRP,）,始发现于,1967,年；,多重耐药,肺炎链球菌,（,MDR,）,1977,年首次在南非爆发流行。,精选课件,49,1.肺炎链球菌的耐药机制青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）的耐,肺炎链球菌对,奎诺酮类,抗生素的耐药主要是由该菌产生,拓扑酶,所致。,精选课件,50,肺炎链球菌对奎诺酮类抗生素的耐药主要是由该菌产生拓扑酶所致,肺炎链球菌对,大环内酯类,抗生素的耐药机制主要为,靶位,的改变，即核糖体,50S,亚单位改变所致，由,ersB,(erythromycin resistance methylase),基因介导，其耐药表型为,MLS,，即对大环内酯类、林可酰胺类和链阳霉素,B,交叉耐药。另一耐药机制为,主动外排,系统，由,mefA,基因介导，其耐药表型为,M,，即对,14,元环（红霉素、罗红霉素、克拉霉素、地红霉素、氟红霉素）、,15,元环（阿奇霉素）大环内酯类低水平耐药，而对,16,元环大环内酯类（罗他霉素、柱晶白霉素、交沙霉素、麦迪霉素、麦白霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、米欧卡霉素）、林可霉素和链阳霉素,B,敏感。,精选课件,51,肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要为靶位的改变，即,耐青霉素肺炎链球菌的传播主要有两种途径,:,(1),克隆传播,，是耐药菌株从一个国家或地区传播到另一个国家或地区。,(2),基因水平转移,，是把耐药基因转移到敏感菌株中。,过度使用抗生素,是耐药菌株传播的危险因素。一般认为在抗生素的压力选择下，敏感菌株被杀死，耐药菌株确能生存下来,或者其他相关链球菌耐药的,DNA,序列通过基因转移在肺炎链球菌之间传播。,研究发现证实儿童鼻咽部存在,“,隐匿性耐药克隆株,”,。,随着我国儿童,-,内酰胺类抗生素大量使用,可以预计不久的将来,不敏感的肺炎链球菌将会急剧增加。,精选课件,52,耐青霉素肺炎链球菌的传播主要有两种途径:精选课件52,2.,耐青霉素肺炎链球菌的检测,纸片扩散法对,内酰胺类药物结果的准确性不够，用,1,g/,片苯唑西林,(OX),筛选肺炎链球菌对青霉素耐药时，当抑菌环直径小于,20mm,时，就必须做稀释法证实是耐药。,精选课件,53,2.耐青霉素肺炎链球菌的检测 纸片扩散法对内酰胺,精选课件,54,精选课件54,3.,肺炎链球菌的药敏报告,用,1ug/,片,苯唑西林纸片测试青霉素敏感性，当抑菌环,20mm,或,MIC0.06ug/ml,可报告青霉素敏感。并同时可报告氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林,/,克拉维酸、头孢克罗、头孢地尼、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢噻肟、头孢丙烯、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南敏感而不需要再测定这些药的敏感性。,精选课件,55,3.肺炎链球菌的药敏报告用1ug/片苯唑西林纸片测试青霉素敏,肺炎链球菌的药敏报告（续,1,）,当苯唑西林抑菌圈,19mm,时应确定青霉素、头孢噻肟或头孢曲松的,MICs,，因为抑菌环,19mm,可以发生在青霉素耐药、中介或敏感菌株中。,精选课件,56,肺炎链球菌的药敏报告（续1）精选课件56,肺炎链球菌的药敏报告（续,2,）,当从,血液,或,脑脊液,中分离出肺炎链球菌，应常规报告,MICs,。测定的药物应包括青霉素、头孢噻肟或头孢曲松、美罗培南和万古霉素。,精选课件,57,肺炎链球菌的药敏报告（续2）精选课件57,4.,肺炎链球菌感染的治疗,青霉素,G,敏感,均可直接用青霉素,G,进行治疗,;,青霉素,G,中度耐药,株可用大剂量青霉素,G,进行治疗；,如,重度耐药,可选用三代头孢菌素加万古霉素或利福平进行治疗。,精选课件,58,4.肺炎链球菌感染的治疗青霉素G敏感均可直接用青霉素G进行治,总 结,1.,肺炎链球菌寄居于人的上呼吸道中，是,条件,致病菌,；,2.,肺炎链球菌,对营养要求较高,，在含有新鲜血液,的培养基中生长良好；,3.,以,optochin,试验和,胆汁溶菌,试验将肺炎链球菌,与其他,溶血链球菌相区别；,4.,血清学,鉴定特异性高；,5.,要注意对,PRP,和,MDR,的检测。,精选课件,59,总 结1. 肺炎链球菌寄居于人的上呼吸道中，是条件精选课件,谢谢！,精选课件,60,谢谢！精选课件60,