第七章-核酸提取与鉴定课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,.,*,第七章,核酸提取与鉴定,1,.,第七章1.,1,核酸的提取与鉴定,第一节 预处理,第二节 DNA的提取,第三节 RNA的提取,第四节 核酸的鉴定,概述,2,.,1 核酸的提取与鉴定第一节 预处理 第二节,研究对象：,基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA,过程：,裂解：,破碎细胞，使细胞中的核酸游离在裂解体系中,纯化：,使核酸与其它杂质彻底分离，如蛋白质、盐等,一、概 述,总原则：,应保证核酸一级结构的完整性；,排除其它分子的污染。,鉴定：,浓度、纯度、分子量、测序,（技术：分光光度技术、凝胶电泳技术等）,3,.,研究对象：基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA过程：,1、植物样品,新鲜组织,先用无菌生理盐水洗；,干药材除去霉点，无菌水浸洗；,（一）样品预处理（获取分散细胞）,捣碎或剪碎；加,液氮,研磨成粉状。,4,.,1、植物样品 （一）样品预处理（获取分散细胞） 捣碎或剪,2、动物样品,（1）组织样品：,新鲜样品,，生理盐水洗，直接使用（或分装、-70/液氮低温保存）；,甲醛固定组织,要先去掉甲醛；,石蜡包埋组织,要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处理。,5,.,2、动物样品（1）组织样品：新鲜样品，生理盐水洗，直接使用（,（2）血细胞样品：,（3）培养细胞：,离心，弃细胞培养液；,用缓冲液多次漂洗；,来源：,新鲜血液或者冻贮血液；,抗凝剂：,一般用,EDTA-Na,2,或,柠檬酸钠（枸橼酸钠 ），,不可使用,肝素；,分离：,红白细胞，一般用明胶，加缓冲液悬浮白细胞。,（血清DNA是研究肿瘤的材料之一）,6,.,（2）血细胞样品：（3）培养细胞： 离心，弃细胞培养液；来源,3、微生物培养物样品,离心获取菌体细胞，,加缓冲液洗涤，,加缓冲液悬浮菌体细胞。,4、微生物混合样品,用缓冲液悬浮菌体，低速离心，沉淀杂质。,高速离心获取菌体细胞。,用缓冲液洗涤菌体细胞。,加缓冲液悬浮菌体细胞。,7,.,3、微生物培养物样品4、微生物混合样品7.,（二）提取用具预处理,1、DNA提取用具的处理,要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无DNA酶处理。,2、RNA提取用具的处理,要求无菌，防止二次污染。,RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温，提取条件要求严格。,8,.,（二）提取用具预处理1、DNA提取用具的处理2、RNA提取用,二、真核生物基因组DNA的常规提取,裂解细胞，溶出DNA,除去杂质,重新溶解DNA,沉淀、浓缩DNA,9,.,二、真核生物基因组DNA的常规提取裂解细胞，溶出DNA除去杂, 破碎细胞，溶解DNA：,用提取液（裂解液）破坏细胞壁、细胞膜和核膜。,微生物样品提取液：含表面活性剂SDS、溶菌酶等,动物样品提取液：含SDS、蛋白酶K等,植物样品提取液：含CTAB,核酸酶可被Ca,2+,、Mg,2+,等激活，提取液均含有螯合剂（如EDTA，柠檬酸等），螯合这些离子。,10,., 破碎细胞，溶解DNA：10.,2、除去杂质（主要是蛋白质）,（SDS，破膜、蛋白质变性沉淀）苯酚抽提蛋白质氯仿抽提、萃取苯酚,经离心后溶液分为三层：上层是核酸溶液、中间不溶物为变性蛋白质，下层是苯酚氯仿溶液。,蛋白质,苯酚氯仿,核酸溶液,11,.,2、除去杂质（主要是蛋白质） （SDS，破膜、蛋白质变性沉淀,3.沉淀DNA,有机溶剂沉淀DNA：2倍体积无水乙醇（或1倍体积的异戊醇）,再用75%乙醇清洗多次。,4.重新溶解DNA,将DNA溶于水或TE溶液。,12,.,3.沉淀DNA12.,CTAB法原理,（植物DNA提取经典方法）,CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。,该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。,基因组DNACTAB法,13,.,CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexa,SDS法原理,基因组DNASDS法,SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；,提高盐(KAc或NH,4,Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,14,.,SDS法原理基因组DNASDS法SDS是一种阴离子去垢剂,DNA,提取的一般流程,15,.,DNA提取的一般流程15.,三、质粒DNA的提取,质粒DNA特点：,（1）细菌基因组DNA以外的小型闭合环状双链DNA分子。,（2）大都含有抗生素抗性基因。,（3）可自我复制或表达。,（重组DNA技术中构建载体）,（4）大小1-300 kb。,16,.,三、质粒DNA的提取质粒DNA特点：16.,1、培养细菌和扩增质粒,加适当的抑制剂（如氯霉素），抑制细菌蛋白质合成，抑制细胞分裂，但质粒会继续复制。,17,.,1、培养细菌和扩增质粒 加适当的抑制剂（如氯霉素），抑制细菌,2、收获细菌和溶菌,离心收集细菌细胞。,细菌裂解方法：,机械法,化学试剂法 （SDS）,溶菌酶化学试剂联合法（最常用）,18,.,2、收获细菌和溶菌 离心收集细菌细胞。18.,3、分离质粒DNA,基因组DNA与质粒DNA分离,碱裂解法（最常用）,用溶液1（EDTA）悬浮菌体。,溶液2（NaOH和SDS）裂解菌体，蛋白质与DNA发生变性。,溶液3中和pH，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，基因组DNA不复性与蛋白质形成絮状沉淀。,离心后，质粒DNA留在上清液中。,19,.,3、分离质粒DNA基因组DNA与质粒DNA分离碱裂解法（最常,通过加热，使细菌裂解、蛋白质和DNA变性。,降低温度，质粒DNA复性留于上清液，基因组DNA复性很慢与蛋白质形成沉淀，可通过离心除去。,煮沸裂解法（偶尔用）,梯度离心法（极少用）,基因组DNA断裂，吸附大量EB，密度大；质粒DNA密度小。,利用氯化铯梯度离心，分离基因组DNA和质粒DNA。,20,.,通过加热，使细菌裂解、蛋白质和DNA变性。煮沸裂解法（偶尔用,离心分离后，吸取含有质粒DNA的上清液。,用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白质。,用乙醇或异戊醇沉淀质粒DNA（与基因组DNA方法同）。,4、质粒DNA的纯化,蛋白质,苯酚氯仿,核酸溶液,21,.,离心分离后，吸取含有质粒DNA的上清液。4、质粒DNA的纯化,四、RNA的提取,（一）总RNA的提取,所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：,样品细胞或组织的有效破碎；,有效地使核蛋白复合体变性；,对内源RNA酶的有效抑制；,有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；,对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。,最关键的是抑制RNA酶的活性。,22,.,四、RNA的提取（一）总RNA的提取所有RNA的提取过程中都,常用的RNA酶抑制剂,焦磷酸二乙酯（DEPC）：,是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。,异硫氰酸胍：,可裂解细胞并抑制RNA酶，目前被认为是,最有效的RNA酶抑制剂,。,RNA酶的蛋白抑制剂(,RNAsin,)等。,23,.,常用的RNA酶抑制剂 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但,（1）提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备,塑料制品：,使用灭菌的一次性用品。或用0.1DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用氯仿处理）。,玻璃用品：,使用前于180的高温下干烤6h以上，或在220下干烤3h以上。,有机玻璃的电泳槽等，,可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再用3H,2,O,2,室温浸泡10min，然后用0.1DEPC水冲洗，晾干。,24,.,（1）提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备塑料制品：使用灭菌,所需溶液的配制：,必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。,严格来说，所有溶液均应用0.1DEPC于37处理12小时以上，然后于100加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。,25,.,所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂,在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩，应勤换手套。,（2）RNA提取中RNase污染的控制,26,.,在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩，应勤,27,.,27.,RNA的提取方法,1、异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法,使用蛋白质强变性剂异硫氰酸胍裂解组织和有效抑制RNA酶的活性；,再进行CsCl密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清液中。,这种方法能得到高质量的RNA，同时分离出细胞染色体DNA。,28,.,RNA的提取方法 1、异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法28.,2、盐酸胍-有机溶剂法,利用盐酸胍使蛋白质变性，抑制RNA酶；,3、氯化锂-尿素法,利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶；,氯化锂选择性沉淀RNA。,其缺点是有时会存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA会丢失一些小分子RNA。,29,.,2、盐酸胍-有机溶剂法利用盐酸胍使蛋白质变性，抑制RNA酶；,4、一步快速热酚抽提法,将异硫氰酸胍、巯基乙醇和去污剂SDS等联合使用，抑制RNA的降解，裂解细胞，增强对核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白质分离；,用高温苯酚、氯仿等抽提去除蛋白质和DNA，乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA。,此法操作简便快速，可在3小时以内处理大批样品，对大量或少量组织的细胞RNA提取均甚合适。,30,.,4、一步快速热酚抽提法将异硫氰酸胍、巯基乙醇和去污剂SDS等,5、试剂盒快速提取法,裂解液含胍盐，抑制RNA酶，使蛋白质和DNA同时变性；,氯仿等抽提去除蛋白质和DNA；,乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA；,此法操作简便快速。,31,.,5、试剂盒快速提取法裂解液含胍盐，抑制RNA酶，使蛋白质和D,Trizol一步提取总RNA：,TRIzol的主要成分是,异硫氰酸胍,和,苯酚,。,异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。,苯酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。,32,.,Trizol一步提取总RNA：TRIzol的主要成分是异硫氰,1）实验前取冰，4离心机预冷，DEPC处理水,（高压灭菌处理）,配制的75%乙醇4预冷；,步骤：,2）1ml Trizol匀浆好的样品；,3）加入,0.2ml氯仿,，,颠倒,混匀（,15秒,）,“慢”，氯仿使蛋白变性,4）,室温,，静置,3分钟,；,5）离心机,4、14000转/分，离心15分钟,；静置,1分钟,（分层即可；样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要存在于水相中）,6）,取上清0. 5ml,（注意：取最上层水相，小心污染，宁可吸少点也不要吸到中间层的物质）,放入另一个1.5ml的EP管中；,7）加入等体积的,异丙醇,（0.5ml），涡旋混匀；,33,.,1）实验前取冰，4离心机预冷，DEPC处理水（高压灭菌处理,8）,室温,，静置,10分钟,（该条件由Trizol试剂盒提供；其他提供的条件用-20、1小时，目的为了更好分层）,9）离心机,4、14000转/分，离心10分钟,10）,弃上液,(移液器调至1ml，分两步快速轻轻吸弃上清：第1步，沿液面吸弃约0.9ml上清；第2步，沿液面吸弃其余上清;注意吸头不要接触到沉淀斑区）,11)沿试管内壁轻轻加入,1ml 4预冷的75%乙醇,注意切勿冲击到沉淀斑区,12）离心机,4、10000转/分，离心5分钟,13）,弃上液,（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过程中把RNA烤干），,60,恒温箱干燥,5分钟,（注意：打开管盖；或用真空干燥5分钟）,14）加入,50l DEPC处理水,溶解,（可以根据管底的白色沉淀判断RNA量的多少加DEPC处理水）,15）,-80,冰箱保存。,34,.,8）室温，静置10分钟（该条件由Trizol试剂盒提供；其他,组织匀浆,35,.,组织匀浆 35.,（二）mRNA的提取,从总RNA中分离mRNA，,用Oligo（dT）层析柱。,mRNA含polyA，在高盐浓度条件下与Oligo（dT）结合，其他成分被洗掉，再用低盐浓度洗脱mRNA。,36,.,（二）mRNA的提取从总RNA中分离mRNA， 36.,（一）核酸浓度检测,OD,260,1时（比色皿厚度1.0cm）,双链DNA浓度为50 g/ml，,单链DNA或RNA浓度为40 g/ml。,DNA(g/ml) = OD,260,50,RNA（g/ml ） = OD,260,40,五、核酸的鉴定,37,.,（一）核酸浓度检测 OD2601时（比色皿厚度1.0cm）,（二）核酸纯度检测,（,紫外吸收法,）,核酸在,260 nm,处有吸收峰，蛋白质在280 nm有吸收峰,核酸的纯度用,OD,260,/OD,280,比值表示。,DNA样品：,OD,260,/ OD,280,1.8 ，DNA纯度高,OD,260,/ OD,280, 1.8，含RNA，或DNA部分降解OD,260,/ OD,280, 1.8，含苯酚或蛋白杂质,RNA样品：,OD,260,/ OD,280,1.82.0 RNA纯度高, 2.0，RNA出现降解,38,.,（二）核酸纯度检测（紫外吸收法）核酸在260 nm处有吸收峰,（三）核酸完整性检测,核酸样本的完整性和分子量可通过,琼脂糖凝胶电泳,测定（RNA常采用,甲醛琼脂糖变性凝胶电泳,），溴化乙锭染色，紫外灯观察。,凝胶上RNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良好的总RNA应该清晰地看到,28s rRNA、18s rRNA、5s rRNA,的三条带，其中,28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍,，5s rRNA 较弱。,电泳：带电颗粒在电场的作用下发生迁移。,39,.,（三）核酸完整性检测核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶,根据电泳支持介质分为,琼脂糖凝胶电泳：,多用于鉴定较大核酸片段（0.160 kb）,聚丙烯酰胺凝胶电泳：,用于鉴定较小的核酸片段（501000 bp）,六、电泳,40,.,根据电泳支持介质分为琼脂糖凝胶电泳：六、电泳40.,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖是从琼脂中提纯出来的一种多糖。凝胶具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。,琼脂糖浓度(),线型DNA分子的分离范围(kb),0.3,560,0.6,120,0.7,0.810,0.9,0.57,1.2,0.96,1.5,0.23,12.0,0.12,41,.,琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是从琼脂中提纯出来的一种多糖。凝胶具有刚,琼脂糖凝胶电泳装置,42,.,琼脂糖凝胶电泳装置 42.,琼脂糖凝胶电泳有许多优点：,操作简单，电泳速度快，分离核酸范围广；,电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；,电泳后区带易染色，便于定量测定；,可用于核酸的纯化和分离（电洗脱法）；,可制成干膜可长期保存。,43,.,琼脂糖凝胶电泳有许多优点：43.,RNA可以使用,非变性或变性凝胶电泳,进行检测。,在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，但是无法确定分子量。,44,.,RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。44.,RNA变性电泳：,RNA为单链分子，局部形成发卡结构，直接电泳无法确定分子量。,只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，迁移率才与分子量成正比。,方法：,电泳前样品保温60， RNA分子伸展。,凝胶中加有甲醛，使RNA在电泳过程中保持单链结构。,45,.,RNA变性电泳：45.,操作流程大致为：,凝胶的制备加样电泳染色观察和拍照,电泳缓冲液：,TAE、TBE（用于电泳和制胶）,46,.,操作流程大致为：电泳缓冲液：TAE、TBE（用于电泳和制胶）,上样缓冲液：,制胶,47,.,上样缓冲液：制胶47.,加样,48,.,加样48.,常用的电泳缓冲液,电泳过程,电泳,49,.,常用的电泳缓冲液电泳过程电泳49.,DNA电泳（紫外灯）,50,.,DNA电泳（紫外灯） 50.,基因组DNA抽提结果电泳图,51,.,基因组DNA抽提结果电泳图 51.,总RNA抽提结果电泳图,mRNA,利用凝胶电泳进行核酸的纯化和回收（电洗脱法）,52,.,总RNA抽提结果电泳图 mRNA利用凝胶电泳进行核酸的纯化和,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。凝胶孔径大小由聚合链的长度及交联度所决定。分辨力高于琼脂糖凝胶电泳，主要用于分子量小的DNA的分离，或在DNA测序中使用，操作复杂。,53,.,聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE，是以聚,聚丙烯酰胺凝胶制胶装置,54,.,聚丙烯酰胺凝胶制胶装置54.,此课件下载可自行编辑修改，此课件供参考！,部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！,此课件下载可自行编辑修改，此课件供参考！,